slit2过表达对心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究

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1、广东药科大学硕士学位论文广东药科大学硕士学位论文分类号：___________密级:公开UDC:___________Slit2过表达对心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究姓名：李想学号：2111345018院系：基础学院专业：病理学与病理生理学研究方向：转基因动物疾病模型与新药筛选研究导师：黄韧研究员论文提交日期：2018年3月论文答辩日期：2018年5月学位授予单位：广东药科大学二○一八年五月广东药科大学硕士学位论文StudyintherolesandunderlyingmechanismsofSlit2overexpressioninmyocardialische

2、miareperfusioninjuryCandidate：LiXiangStudentID：2111345018Affiliation：SchoolofBasicCoursesAcademicDegreeApliedfor：MasterofMedicineSpeciality：PathologyandpathophysiologySupervisor：Prof.HuangRenAssistantSupervisor：Prof.YangFenghuaDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPh

3、armaceuticalUniversity52018广东药科大学硕士学位论文广东药科大学硕士学位论文Slit2过表达对心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究摘要缺血性心脏病（ischemicheartdisease，IHD）是冠状动脉狭窄导致心肌缺血而诱发的心脏疾病，其死亡率在全球所有死因中居首位，已引起巨大的社会经济负担，因此急需发展更好的防治策略。目前临床上治疗IHD的基本策略是通过各种手段尽快恢复血流供应以减少心肌梗死面积，然而在恢复血流供应的同时常会因氧自由基增加、ATP合成失衡、钙超载、炎性因子进入循环系统及胞内应激信号系统激活等原因诱发心肌功能障碍，这种现象

4、被称为缺血再灌注损伤（ischemiareperfusioninjury，IRI）。随着对缺血再灌注（ischemiareperfusion，IR）后心肌损伤机制的逐渐阐明，包括我们在内的研究者们把研究重心已转向探索避免再灌注损伤的途径以及相关的保护机制，目前在这两方面均存在诸多疑问未解。Slit蛋白最早因其具有导向神经元轴突发育作用而被关注，随后发现其在白细胞趋化募集、肿瘤发生、心脏腔室形成、干细胞分化等多个生物进程中起着重要作用。然而，我们对Slit蛋白介导的胞内信号转导机制的了解只是冰山一角。已知作为外分泌蛋白，Slit2蛋白可通过与细胞膜上Robo受体结合调控胞

5、内的各种事件，包括磷酸化信号通路的激活、脂肪代谢的改变、钙信号调控和肾脏缺血后白细胞募集的抑制等。基于我们前期对心肌IR的探索，这些应激保护和心肌IRI保护的机理相同，由此，我们设想Slit2蛋白参与心肌IR的信号调控，并且保护心脏功能。为验证I广东药科大学硕士学位论文这一设想，本论文选择了人源Slit2（hSlit2）过表达小鼠（Slit2-Tg）为工具鼠，建立离体心脏IR模型，对Slit2调控心肌IR保护作用的机制进行探讨。本论文设计了三部分研究内容：1）明确hSlit2基因在Slit2-Tg小鼠心脏中过表达，并探讨过表达对小鼠心脏的影响；2）构建小鼠离体心脏IRI

6、模型，明确hSlit2过表达对心肌IRI是否具有保护作用；3）探讨hSlit2过表达影响心肌IRI的分子机制。选取8周龄左右的Slit2-Tg和C57BL/6J小鼠，取其心脏，通过半定量PCR和Westernblotting实验确定hSlit2基因在Slit2-Tg小鼠的心脏上过表达，利用QPCR进一步确认hSlit2过表达对鼠源Slit（mSlit）亚型的影响，通过小动物超声系统和心脏组织HE染色检测Slit2-Tg小鼠的心脏功能及组织结构的变化。随后，离体小鼠心脏做langendorff离体心脏灌流实验，来判断hSlit2过表达对IR后心脏功能恢复的影响，同时利用T

7、TC染色检测梗死心肌的面积，用HE染色检测心肌组织结构的变化，并用电镜检测心肌细胞亚细胞结构的损伤情况。提取心肌丝蛋白，利用Pro-Q和Westernblotting实验来探讨hSlit2过表达调控IRI的分子机制：首先运用Pro-Q实验检测心肌丝肌小节蛋白磷酸化的改变，随后用Westernblotting实验来检测肌小节蛋白的磷酸化位点，最后用Westernblotting实验检测调控肌小节蛋白磷酸化的PKC亚型及蛋白磷酸酶的表达水平。研究发现，与C57BL/6J小鼠相比，hSlit2在Slit2-Tg小鼠的心脏中高表达，但这种改变对S