葡萄籽原花青素对牙龈卟啉单胞菌lps及bbf影响的实验研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌大堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作槲(矧：亥饧彳鳓渺噼⋯’日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文

2、的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)1r胛＼学位论文作者签名(手写)：讫励御导师签名(手写)：＼∥f＼，．／r签字日期：仞B年多月竺日签字E1期：矿1々年D月／日摘要背景和目的：近年来，中医在医学领域发挥着越来越重要的作用。很多学者已发现中医在治疗口腔疾病方面

3、的可行性。中草药来源于天然植物，副作用小，不易使细菌产生耐药性。葡萄籽原花青素(GSPE)是一种纯天然的抗氧化剂，具有较强的抑菌作用。现研究表明牙龈卟啉单胞菌在牙髓、牙周疾病以及口臭的发生、发展中都发挥着重要作用。牙龈卟啉单胞菌是G。厌氧短杆菌，其分泌的内毒素(LPS)等毒力因子以及形成的生物膜(BBF)能够逃避宿主的免疫防御系统，破坏宿主牙周组织。目前GSPE对牙龈卟啉单胞菌抑制作用的研究鲜见报道。本实验拟通过GSPE对牙龈卟啉单胞菌的内毒素及生物膜的影响作用研究，探索GSPE在治疗口腔疾病方面的可行性，为研究开发预防牙周疾病以及口臭等方面的

4、高效低毒的药物及相关性食品奠定理论基础。材料和方法：实验一：GSPE对牙龈卟啉单胞菌的最低抑菌浓度将牙龈卟啉单胞菌冻干菌在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)内复苏，增菌以及继代培养，挑取培养好的菌株，用PBS缓冲液将菌液校正至O．5麦氏比浊标准的菌液备用。将GSPE用无菌去离子水配制原花青素溶液128mg／ml的原液，然后倍比稀释配制不同浓度，取各浓度药液1．50ml与50℃TSB琼脂培养基13．50ml混匀，倾注平板使其终浓度为12．8mg／ml，6．4mg／ml，3．2mg／ml，1．6mg／ml，O．8mg／ml，0．4mg／ml，0．2m

5、g／ml，0．1mg／ml，0．05mg／ml。分别取2ul菌液在不同浓度的平板上点种。37。C厌氧培养48h。以肉眼所见平板上无细菌生长的最低浓度为GSPE的最低抑菌浓度。实验重复三次实验二：采用鲎试验测定GSPE对P．g产生LPS的影响在无热源管中，分别配制2mlGSPE溶液终浓度为O．8mg／ml，0．4mg／ml，0．2mg／ml，O．1mg／ml，0．05mg／ml，O．025mg／ml的TSB液体培养基，以及不含GSPE只有2mlTSB液体培养基的空白对照组，各组分别加入细菌混悬液(1×106cfu／m1)0．1ml，37。C厌氧培

6、养72h。分别吸取7组不同实验样品0．2ml加入鲎试剂中，振荡后，置检测仪上检测。实验重复三次。II摘要实验三：GSPE对牙龈卟啉单胞菌生物膜的影响将配制好的菌液(1×106cfu／m1)分别加入96孔板中，每孔0．1ml。37℃恒温厌氧培养5天后96孔板内壁附着生物膜。将96孔板中菌液倾出。96孔板分四组，1．3列为实验组，自A．F行依次加入3．2mg／m1．0．1mg／ml梯度浓度的GSPE溶液。4-6为阳性对照组加入O．14％．0．0045％梯度浓度的次氯酸钠，7-9为阴性对照组，10．12为背景对照组，只加药液。培养24h后用PBS溶液

7、轻柔清洗三次，结晶紫染色30分钟后倒出清洗，脱氧胆酸钠脱色30min后，置酶标仪测OD值。实验重复六次。结果：1、肉眼可见，GSPE溶液浓度为0．05mg／ml，O．1mg／ml，0．2mg／ml，0．4mg／ml的TSB琼脂培养基上都长有少量细菌，而浓度为0．8mg／ml，1．6mg／ml，3．2mg／ml，6．4mg／ml，12．8mg／ml的TSB琼脂培养基上均无细菌生长，故可认为O．8mg／mlGSPE溶液为最低抑菌浓度。2、鲎实验结果显示，GSPE浓度为0．4mg／ml，0．2mg／ml，0．1mg／ml，0．05mg／ml，0．02

8、5mg／ml时反应结果呈阳性，浓度为0．8mg／ml时反应结果呈阴性。统计结果显示在0．05．0．4mg／ml范围内随着GSPE浓度的升高，对LPS抑