猪获能精子磷酸化蛋白质组学鉴定及蛋白互作网络分析

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1、上海交通大学硕士学位论文猪获能精子磷酸化蛋白质组学鉴定及蛋白互作网络分析学校：上海交通大学院系：农业与生物学院班级：B1015092学号：1101509063学科专业：动物遗传育种与繁殖作者姓名：张媛媛指导教师：李新红副教授答辩日期：2013年01月万方数据DissertationsubmittedforrequirementofMaster’sdegreePHOSPHOPROTEOMICSIDENTIFICATIONANDPROTEININTERACTIONNETWORKANALYSISOFBOARSPERMGraduat

2、eZhangYuanyuanSupervisorAssociateProf.Xin-hongLiMajorVeterinaryBiotechnologyShanghaiJiaoTongUniversityShanghai,ChinaJanuary,2013万方数据万方数据万方数据上海交通大学硕士学位论文猪获能精子磷酸化蛋白质组学鉴定及蛋白互作网络分析摘要哺乳动物新鲜精子必须在雌性生殖道有限时间内发生一系列生理、生化等分子事件，才能够具备受精能力。成熟精子作为高度分化的特异细胞，除依赖于线粒体型核糖体合成少量蛋白之外，基本上没

3、有转录、翻译功能。而蛋白质磷酸化作为最为普遍的翻译后修饰之一，对精子的获能、超激活运动的维持、顶体反应的发生等受精关键环节十分重要。因此哺乳动物精子磷酸化蛋白质组学研究成为近些年相关研究中的热点。迄今为止，尚未有文献报道猪精子磷酸化蛋白质组学的研究，基于此本文以猪新鲜精子作为实验材料，利用双向电泳、蛋白免疫印迹技术、蛋白质免疫沉淀技术、磷酸化肽段富集及LTQ-MS/MS质谱鉴定技术，分离并鉴定猪新鲜精子、获能精子相关磷酸化蛋白及磷酸化位点，发掘与受精相关的重要生物标志物，从精子磷酸化蛋白质组学角度探讨猪获能精子受精潜能变化的

4、分子机制。利用生物信息学研究方法，构建猪精子磷酸化蛋白调控网络及关键磷酸化蛋白生物学功能预测，为进一步开展哺乳动物精子磷酸化蛋白重要信号分子调节通路及受精分子机理研究提供科学依据。本论文主要做了三部分的研究工作：1.通过双向凝胶电泳技术（TD）、蛋白质免疫印迹技术（TD-WB）与（MALDI-TOF-MS）质谱技术相结合方法来鉴定猪精子在获能过程中发生酪氨酸磷酸化的蛋白质。通过对猪精子细胞蛋白裂解提取、双向凝胶电泳等电聚焦及蛋白免疫印迹（TD-WB）抗体浓度等条件的摸索，建立猪精子双向电泳—蛋白免疫印迹—质谱鉴定研究技术方法

5、。通过双向凝胶电泳图谱与免疫印迹图谱对点切胶质谱共鉴定出11种差异酪氨I万方数据上海交通大学硕士学位论文酸磷酸化蛋白，其中3种蛋白Acrosinbindingprotein（ACRBP）、Voltage-dependentanionchannel2（VDAC2）以及Tubulinalpha-1C（TUBAC）在小鼠及人类精子相关研究已有报道；另外包括Tropomyosin3（TPM1）和Whirlin等8种为哺乳动物精子中新鉴定的酪氨酸磷酸化蛋白。2.利用酪氨酸磷酸化抗体（α-PY）免疫沉淀（IP）技术富集获能猪精子酪氨酸磷

6、酸化蛋白，经串联质谱（LC-MS/MS）鉴定蛋白的种类，共鉴定出120种猪获能精子酪氨酸磷酸化蛋白，对30种功能已知蛋白功能分类结果显示，其中线粒体蛋白、酶类、精卵融合相关蛋白和细胞骨架蛋白所占比例较高。线粒体蛋白多为线粒体内膜运载体家族蛋白（MSCF），参与代谢物的跨膜转运；酶类以磷酸酶和糖代谢相关酶类为主；精卵融合相关蛋白主要参与精卵识别、结合、融合、粘附相关蛋白；另外细胞骨架蛋白，如微管蛋白（TUBB2A）、外周致密纤维蛋白（ODF2）蛋白激酶A锚定蛋白（AKAP-3、AKAP-4）等，均与精子鞭毛运动有关。为进一步鉴

7、定出酪氨酸磷酸化位点，利用TiO2富集磷酸化肽段技术富集免疫沉淀（α-PY-IP）分离得到蛋白的磷酸化肽段，质谱（LTQ-MS/MS）检测共鉴定出9个酪氨酸磷酸化位点。此部分鉴定结果中有一种特殊的细胞核蛋白LRRFIP1，其包含coiled-coil结构域用以结合富含亮氨酸的重复序列（LRR），是经典Wnt信号通路激活因子及信号转导的关键分子。3.采用TiO2富集磷酸化肽段技术富集猪获能精子全蛋白中磷酸化肽段，在此基础上利用高精度的LTQ-MS/MS质谱鉴定技术，共鉴定得到猪获能精子375种磷酸化蛋白，612个磷酸化肽段，共

8、1067个磷酸化位点（Ser位点775个，Thr磷酸化位点207个，Tyr磷酸化位点85个），Ser/Thr/Tyr磷酸化分布比例为72.6：19.4：8.0（%），统计发现这些磷酸化蛋白质中具有结合功能的蛋白、代谢蛋白所占比例相对较大。通II万方数据上海交通大学硕士学位论文过蛋白质之间相