用于快速检测猪瘟抗体双功能分子构建及表达

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1、用于快速检测猪瘟抗体双功能分子的构建及表达摘要猪瘟(ClassicalSwineFever,CSF)是由猪瘟病毒引起的猪的一种急热性、致死性疾病。给世界养猪业造成了巨大的经济损失。对猪瘟抗体进行定期监测对猪瘟的防制具有重要意义，针对目前还没有一种适合基层单位使用的、简便、快速、稳定的猪瘟抗体检测方法的现状，本项目根据红细胞凝集试验的原理开展用于快速检测猪瘟抗体的双功能试剂方面的研究。研究主要结果如下：1、双功能分子的拼接及其原核表达载体的构建采用重叠延伸拼接(SOE)PCR的方法将2E8ScFv(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和mE2(猪瘟E2基因主要抗原区基因)拼接成融合双功能分子，命名为

2、2E8mE2，将融合基因克隆入PMDl8．TSimple载体，测序正确后，再亚克隆入PET-DsbA原核表达载体，通过PCR和酶切鉴定，均能获得大约1125bp的目的条带。表明原核表达载体PE■DsbA．2E8InE2构建成功。2、2E8mE2重组蛋白的表达将PE-DsbA-2E8II也2重组质粒转化BL21(DE3)PlysS原核表达菌株，用常规方法进行表达，经超声波裂解，SDS．PAGE电泳分析重组蛋白的性质，然后通过不同的温度、IPTG浓度、诱导时间的梯度来筛选最佳表达条件。结果表明：2E8mE2重组蛋白获得了高效表达，占细菌总量的30％；表达产物大部分是以不溶的包涵体形式存在；在37

3、℃，IPTG浓度为0．3mmol／L，诱导时间为3h的条件下重组蛋白可获得最佳表达。分别用6×His单克隆抗体和CSFV高免血清对表达的重组蛋白进行Western．blot检测，结果显示：重组蛋白与6xHis单克隆抗体及CSFV阳性血清均呈阳性反应，呈现清晰的特异性反应条带，而空载体诱导菌的菌体蛋白无上述反应条带。表明所表达的重组蛋白是特异的。3、2E8mE2重组蛋白包涵体的复性及检测超声波破碎处理重组菌，收集重组蛋白包涵体，用0．5％TritonX-100和lmol／LNaCI洗涤包涵体后用尿素溶解，利用Ni．NTA树脂对溶解的蛋白进行亲和层析纯化，然后利用谷胱甘肽再氧化法对纯化的变性溶解

4、蛋白进行复性，最后利用间接ELISA方法测定复性后的重组蛋白与CSFV高免血清的反应性，结果显示：用洗涤的方法初步纯化后，目的蛋白纯度已经能达到86％，再通过亲和层析法的进一步纯化，蛋白纯度高达92％，纯化后的重组蛋白用谷胱甘肽再氧化法进行复性，复性后的重组蛋白与CSFV高免血清的反应性明显高于复性前的变性蛋白，提高了约3-4倍，表明复性是成功的。．关键词：猪瘟单链抗体双功能分子原核表达包涵体复性ⅡCONSTRUCTIONANDEXPRESSIONOFBIFUNCTIONAILMOLECULEOFDETECTINGCSFANTIBODYQUICKLYClassicalswinefever(C

5、SF)causedbyClassicalswinefevervirus(CSFV)isakindofurgentfebricityandfataldisease．Ithasmadeagreatlossinworld’Sswineindustry．monitoringregulaurlyCSFantibodyhasimportantsignificancewithcontrolofCSF,atpresent，becausethereisstillnoaconvenientandfastandstabledetectivemethodofCSFantibodytorefertoprimaryle

6、vel，thestudyofbifunctionalreagentofdetectingCSFantibodyquicklyperformedaccordingtotheprincipleofhaemag百utination．Themainresultofstudyasfollow：1．Splicingofbifunctionalmoleculeandconstructionofprokaryoticvector2E8ScFv(ScFvgeneagainstHantigenofhumanerythrocyte)andmE2(mainantigenregionofE2geneofCSDwere

7、splicedbyoverlapextension(SOE)PCRandassembledbifunctionalmoleculenamed2E8mE2，thenitwasdonedintoPMDl8-TSimplevector,thesequencedrecombinantbifunctionalmoleculewassub—clonedintoprokaryoticvectorPET-DsbAandind