猪瘟抗体检测ppt课件

《猪瘟抗体检测ppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、猪瘟抗体ELISA检测2015年12月提纲13254猪瘟抗体检测ELISA原理ELSA基础知识操作过程实验前准备注意事项一、ELISA概念及类型50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术1971年此项技术由瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道，将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其

2、免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。在ELISA方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免

3、疫吸附剂”（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。几种常用的ELISA检测方法双抗体夹心法测抗原（常用）夹心法双抗原夹心法测抗体竞争法测抗原竞争法竞争法测抗体捕获包被法测抗体亲和素-生物素ELISA法间接法测抗体（常用）洗涤液配置：浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。用CSFV样品稀释液20倍稀释待检样品使用前所有试剂盒组分应恢复到18-26℃，并震荡混匀。四、猪瘟ELISA操作过程1、移板：在CSF抗原包被板上加入各100vl阴、阳性对照，阴阳性对照设复空。在相应空中加入100vl已稀释好的样品

4、，封板37℃温育30min。2、洗板，弃去各空液体，280vl/孔已稀释洗涤液洗涤板空，共洗5次，每次洗涤后弃孔内液，最后一次将板空洗涤液拍干。3、加酶结合物，每孔100vl，封板37℃温育30min。4、重复步骤2洗板。5、每孔加入50vl显色A液和50vl显色B液（也可A、B显色液等比例混合后加入100vl），封板37℃温育10min。6、每孔加入50vl终止液，终止反应。7、测量并记录样品和对照的OD值（450nm）结果分析1、实验成立条件阴性对照值=（NC1+NC2）/2阳性对照值=（PC1+PC2）/2实验成立条件：阳性对照平均值-阴性对照平均值≥0.1，阴性对照平

5、均值≤0.1。2、结果判定样品计算S/P=(样品-阴性对照平均值）/（阳性对照平均值-阴性对照平均值）S/P值＜0.4,样品判定为CSFV抗体阳性。S/P值＞0.4,样品判定为CSFV抗体阴性。五、注意事项1、基本操作注意事项加样:在ELISA中一般有3次加样步聚，即加样本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。1、基本操作注意事项保温:抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(或孵育incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育

6、？以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。1、基本操作注意事项洗涤:洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这

7、种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。1、基本操作注意事项显色:显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。1、基本操作