家蚕淡体色(lbc)突变分子机制初探

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1、摘要家蚕淡体色(场c)突变的分子机制初探遗传学专业硕士研究生李元浩指导教师代方银教授鲁成教授育月～习父4．又昆虫是一种分布十分广泛的生物，从海洋、平原到山区都有它们的存在。不同的昆虫具有不同的生活习性与生理生态特征。多数为植食性，少数为肉食性。对于研究人员与收藏家来说。昆虫多彩多样的体色一直以来是他们关注的焦点。昆虫长期以来一直是生物学和医学的模式动物。从摩尔根研究的果蝇到现在研究者广泛使用的赤拟谷盗，昆虫对人们更好地了解与认识自然功不可没。家蚕是一种完全变态昆虫，在中国已有5000多年的养殖与产丝历史。家蚕作为生物模型为人们所

2、研究也已经有一个多世纪的时间。家蚕是鳞翅目的模式昆虫，在长期研究过程中所保存下来的500多种突变体为科研人员研究基因功能与探索发育过程提供了良好的材料。体色突变在家蚕所有突变中占有很大的比例。家蚕的体色主要由三大色素代谢路径所决定：眼色素代谢路径，蝶啶类代谢路径和黑色素代谢路径。每一个色素代谢路径都有多种突变体与之对应，而且不少突变体的突变基因已被克隆，包括：眼色素路径中的w．严，w，．2和，P；蝶啶类路径中的胁；黑色素路径中的6船，拍芦D朋加≯幽等．一些其它色素也会影响昆虫的体色，如尿酸与类胡萝卜素。与之相关的被克隆的突变有：

3、尿酸代谢、转运及累积异常的钾，D易洲，∞等突变；类胡萝卜素转运及累积异常的只C等．家蚕淡体色突变(1i曲tbodycolor’，Ik)是第5染色体的隐性突变，其表型为：突变体卵期与1龄表型正常。第1次蜕皮后全体变为淡色．通过基因芯片筛查与连锁分析，本研究筛选并克隆了z6c突变的的候选基因，同时分析了突变基因的表达特征，并对该基因进行了初步的功能研究。所取得的主要研究结果如下：I．基因芯片分析与舭候选基因筛查，6c突变与野生型2龄幼虫的全蚕芯片数据对比分析结果显示，在D配∞与『6c中表达差异明显的基因共有677个。这些基因涉及转运

4、、几丁质代谢、氨基酸代谢、肌肉发育等生物学过程。进一步的．结合，6c的表型，我们对差异基因的表达部位进行分析．发现在表皮中明显表达的基因共有16个．进一步对此16个基因的预测功能进行分析。我们保留了其中的10个基因作为初步候选，并对此10个基因的CDS在D呦。与f6c中进行了扩增。扩增结果显示，其中的9个并没有表现出明显差异，而有一个基因V在舰突变中的扩增片段的长度明显火于野生型D锄o，结合芯片分析结I两南人学硕十学位论文果，我们将该基因初步确定为，6c突变的候选基因。2．y基因与跏位点的连锁分析我们根据预测的y基因的基因组序列

5、设计了两对标记：Gl与G2。在定位群体的亲本Dazao与F2f代中具有z6c表型的个体间进行多态筛选。结果显示，标记Gl，G2在Dazao与肠c表型的个体中均表现出多态性。利用F2群体中的125个路c表型个体进行分型分析，结果显示，舰突变座位与矿基因间没有发生重组，表明两者紧密连锁。同时，为了进一步确定y与，6c突变的关系，我们在13个不同的家蚕品系中扩增了y基因的CDS序列。电泳结果表明，只有舾c的条带滞后，而其它12个品系带型一致．3．Da功。与腑中y基因cDs的克隆与序列分析我们克隆了D锄。与，6c中矿基因的cDS。序列分

6、析后发现Dazao中的序列与Sill①B中的序列一致，但是在，6c突变体中发现了27bp的插入。在，6c序列中还存在6处单碱基替换。将正常与突变体序列翻译为蛋白质后发现，6处单碱基替换并没有造成氨基酸改变，但是27bp的核苷酸插入造成了Zk基因中9个氨基酸的插入。通过1MHMM在线预测，发现9个氨基酸的插入可能破坏，6c基因所编码蛋白的第3个跨膜结构域。4．y基因在Da髓。中的cDNA全长克隆通过RACE技术．我们克隆了Daz∞的y的全长与，6c中的3’UTR。序列拼接后发现该基因的cDNA全长为693bp，5-UTR为67bp

7、，3’UTR为110bp．并且，我们在z6c的3’UTR中发现了9bp的核苷酸插入。5．y基因的表达模式分析我们对矿基因的时期与组织表达模式进行了分析。组织表达谱结果显示，该基因在幼虫头部，表皮与脂肪体中高表达．而在其它组织中基本不表达．时期表达谱结果显示，该基因在4龄起蚕、4龄第2天、5龄起蚕至5龄第5天和上蔟第4天表达；在4龄2天至4龄眠、5龄第5天至化蛾(上蔟第4天除外)基本不表达。20E注射实验显示：注射组y基因的表达量显著低于对照组，结果表明矿基因的表达可能受到20E滴度的抑制。6．丑m腑与黑色素代谢路径关键基因的定量

8、和氨基酸含量测定利用qRT-PCR技术，我们对砌耽基因与黑色素代谢路径的关键基因剧M阻胱和妒如M，进行了定量分析。结果表明在肠c中，尉日。m胱的表达量分别为Dazao中的3倍，30倍和2倍。但是，弦!，枷的表达量在，6c与D物。中并未表现出明显区别。并且，在，6