福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良差异表达基因的筛选与

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1、福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良差异表达基因的筛选与鉴定1,21*,1111田文霞，张万坡，李家奎，毕丁仁，张艳红,覃平（1．华中农业大学动物医学院，湖北武汉，430070；2．山西农业大学动物科技学院，山西太谷，030801)摘要为从基因差异表达的角度研究肉鸡胫骨软骨发育不良的分子机理,应用抑制差减杂交（SSH）技术构建了福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良肉鸡与正常肉鸡胫骨软骨生长板的正反消减文库。在两个文库中随机共挑选了356个有效克隆,经斑点杂交筛选出30个阳性克隆,测序后经Blastn网上比对揭示了30个基因,其中29个EST是已报道基因的cDNA片段,1个在N

2、CBI数据库中为未知基因。关键词肉鸡胫骨软骨发育不良;抑制差减杂交;基因差异表达;差异表达基因鉴定肉鸡胫骨软骨发育不良(TibialDyschondroplasa,TD)是肉鸡常见的骨骼疾病之一，以骺板[1]成熟面形成不能血管化亦不能矿化的软骨栓为特点。虽然不同品种的肉鸡TD发病率有一定的差异，但通常情况下TD的临床发病率和亚临床发病率可达30%，有时甚至是50%，导致肉鸡抗病性能下降和生产性能降低，诱发胸部囊肿和骨髓炎，降低鸡肉的品质和等级,是目前公认的严重影响现代肉鸡养殖业的三大营养代谢病之一，每年给世界肉鸡养殖业造成巨[2,3]大经济损失。因此，肉鸡TD的发

3、病机理和防治研究是目前世界上禽病研究的热点之一。以往多是采用免疫组化、原位杂交、半定量RT-PCR等对肉鸡TD发生的分子机制进行研究，发现肉鸡患TD时，病变的软骨细胞生长分化相关基因表达紊乱、表达水平降低或表达[4,5,6]缺失的现象。虽然采用以上方法对TD的发生机理作了一定的阐明，但这些方法通常在实验之前就已经假定要研究基因有可能发生变化，然后通过实验手段去求证，每次实验研究的基因数量有限，并且主要是针对已知的基因，因此存在一定的盲目性和局限性。为鉴定疾病过程中是否有新的未知基因参与，本研究采用抑制差减杂交（SSH）技术，筛选肉鸡胫骨软骨发育不良差异表达基因，为

4、进一步研究其表达的时序性，从分子水平认识该病的发病机理，防治肉鸡TD和选育抗TD肉鸡品种提供理论依据。1材料与方法1.1组织样品120羽1日龄健康AA肉鸡，预饲一周后随即分为两组，每组三个重复，每个重复20只鸡。对照组饲以基础日粮，试验组饲以基础日粮添加100mg/Kg福美双，喂72小时（3天）诱发肉鸡胫骨软骨发育不良，以后继续饲以基础日粮，实验期为30d。饲养管理按肉鸡饲养手册进行。在实验的第11、16、23、30天，随机挑选8只鸡宰杀，采集胫骨软骨生长板，迅速投入液氮中冻存。1.2组织总RNA的提取及mRNA的分离从-80℃冰箱中取出保存的组织样本，在研钵中磨

5、碎样品，按照TrizolReagent(Invitrogen)试剂盒说明书操作方法提取生长板总RNA；按照OligotexmRNAMiniKit(Qiagen)试剂盒说明书操作方法分离mRNA。基金项目:国家自然科学基金(30571370)、中国博士后科学基金(2005037201)资助*通讯作者E-mail:lijk210@mail.hzau.edu.cn作者简介:田文霞(1967～)，女，汉族，山西闻喜人，在职博士，主要从事禽病分子机理和免疫学研究1.3抑制差减杂交（SSH）TM具体操作按照ClontechPCR-SelectcDNASubtractiveKi

6、t(Clontech)进行。为了筛选肉鸡胫骨软骨发育不良表达上调基因和表达下调基因，构建正反向两个差减cDNA文库。正向差减cDNA文库：以发病胫骨软骨生长板mRNA反转录，经RsaI完全酶切后所得cDNA作为试验子（Tester），分成两份，连接两种不同的接头adptor1和adaptor2R，完成Tester1-1和Tester1-2cDNA的制备，以正常肉鸡胫骨软骨生长板mRNA反转录，经RsaI完全酶切后所得cDNA即作为驱赶子（Driver），以Tester1-1和Tester1-2cDNA与DrivercDNA进行两轮杂交得到差减cDNA，构建正向差减

7、cDNA文库，命名为BTDF（BroilerTDforward），该文库包含上调表达的基因；反之，构建反向差减cDNA文库，命名为BNR（Broilernormalreverse），该文库包含下调表达基因。DrivercDNA用于扣除TestercDNA中的非差异表达的基因。1.4抑制差减杂交cDNA文库的构建将制备的两种差减cDNA进行二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增产物直接连接pMD18-T载体（宝生物工程大连公司）,将连接产物转化受体菌大肠杆菌DH5α（本试验室保存）,涂布于LB平板(内含50μg/mLAmp)，每200μL涂一块平板。37℃培养12h左右，

8、即获得差减