慢病毒载体初免和牛痘病毒载体加强免疫对黑色素瘤的预防和治疗作用的研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文慢病毒载体初免和牛痘病毒载体加强免疫对黑色素瘤的预防和治疗作用的研究PreventiveandTherapeuticRolesofLentiviralVectorPrimeand’’’7cciniaVirusBoostinMouseMelanomaPrimeandVacciniaViruSoostin0ma课题来源：自选学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院肖海燕富宁教授何玉凯教授免疫学学术型博士研究生基础医学院2013年5月22日广州博士学位论文IMHHHMIHIIY

2、2405701慢病毒载体初免和牛痘病毒载体加强免疫对黑色素瘤的预防和治疗作用的研究博士研究生：肖海燕指导教师：富宁教授何玉凯教授摘要疫苗在抗微生物免疫中取得的巨大成功使得人们开始考虑是否可以用同样的思路来治疗肿瘤。早在1902年Leyden和Blumentha就尝试将肿瘤细胞疫苗用于治疗病人，但结果并不乐观。1959年Graham使用自身肿瘤疫苗治疗了232例妇科肿瘤患者，结果发现虽然自身疫苗可用于治疗患者，少见不良反应，但并不能改变疾病自然病程。尽管经历了挫折和失败，但人们一直没有放弃对肿瘤疫苗的研究。随着人类肿

3、瘤特异性抗原(TumorSpecificAntigen，TSA)和相关抗原(TumorAssociatedAntigen，TAA)被证实及其基因克隆的成功，肿瘤的主动免疫治疗再次受到重视，肿瘤疫苗的研究被推向高潮。肿瘤疫苗通过主动免疫诱导机体特异性细胞免疫和体液免疫反应，发挥特异性杀伤与清除作用，达到治疗肿瘤的作用。与用于预防传染病的经典疫苗不同的是，肿瘤疫苗一般为治疗性疫苗，由于肿瘤免疫抑制性微环境的存在和肿瘤抗原的低免疫原性使得肿瘤疫苗诱导的免疫反应非常有限，提示我们应该开发更好的抗原运载摘要系统以在免疫抑制性

4、的环境内诱导出更强的抗弱免疫原性肿瘤抗原的效应性免疫反应。利用重组病毒载体表达肿瘤抗原诱导机体抗肿瘤免疫反应是非常有效的方法之一。重组牛痘病毒载体(vacciniavirusvector，vv)是第一批用于治疗肿瘤的基因载体，vv具有几个突出的优点：免疫原性强；能够运载较长的基因片段；可感染小鼠和人的所有细胞；具有直接溶瘤效应；安全性良好，不会整合到宿主基因中去；易于制备高浓度的病毒颗粒。因此，vv作为有效实用的病毒载体被广泛用于抗感染和抗肿瘤研究中。例如，有研究者利用vv表达gpl60，诱导机体产生抗HIV免疫反

5、应，vv表达HPV则可诱导抗HPV特异性免疫反应；还有很多报道利用vv表达细胞因子如GM-CSF或者肿瘤相关抗原如CEA用于抗肿瘤治疗。但vv载体部分的高免疫原性限制了携带的目的抗原部分的免疫反应。慢病毒载体(1entiviralvector，iv)只表达目标抗原，因而诱导出的免疫反应以针对目标抗原为主，而针对载体部分的免疫却较弱，因而特别适合用于运载肿瘤抗原的病毒载体。而且，lv能够转染非分裂性(non—dividing)的树突状细胞(Dendriticcells，DCs)，转染后的DCs将lv携带表达的肿瘤抗原

6、有效递呈给免疫细胞，启动一系列免疫反应；另外，lv能够诱导持续性的抗原表达，进而诱导持续性的免疫反应。将表达黑色素瘤相关抗原如NY-ESO，酪氨酸酶相关蛋白l(Tyrosinase—relatedprotein1，TRPl)的lv直接免疫小鼠，机体可产生很强的抗肿瘤抗原特异性免疫反应，并能抑制肿瘤生长。然而，尽管vv和1v是非常优秀的肿瘤疫苗病毒载体，但单一应用疗效有限。我们考虑，这和它们诱导的免疫反应强度和质量有关。传统的疫苗免疫一般是相同疫苗多次免疫以诱导再次免疫应答并增强机体的免疫反应。但机体产生的抗载体免疫

7、影响了目标免疫反应。近十几年以来，有很多报道证明，利用表达相同抗原的不同载体来加强免疫能够诱导更强的免疫反应，能够更有效地治疗肿瘤。所以我们考虑，将1v和vv这两个不同的载体联合应用也许能够诱导更强更有效的免疫反应，从而提高预防和治疗肿瘤的作用。n博士学位论文因此，本研究分别构建了表达人黑色素瘤相关抗原gpl00(glycoprotein100，gpl00)的lv和vv，并制备了用于免疫小鼠的病毒颗粒。以小鼠黑色素瘤为肿瘤模型，研究联合应用hgpl00—1v和hgpl00一vv对黑色素瘤的预防和治疗作用。全部工作分

8、为三个部分简述如下。一、表达人黑色素瘤相关抗原gpl00的重组1v和vv构建及诱导免疫应答的初步鉴定基于目前对异源性DNA疫苗诱导保护性免疫反应优于同源性DNA疫苗的共识，本研究采用了人黑色素瘤相关抗原gpl00为目的抗原，利用常规高保真PCR技术将人gpl00基因的N-末端的340个氨基酸基因片段克隆到慢病毒载体上，成功构建了表达人黑色素瘤相关抗原gpl0