建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中的小肠结肠结肠炎耶尔森菌

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中的小肠结肠炎耶尔森菌Developmentofaloop-mediatedisothermalamplificationfordetectionofYers／n／aenterocoliticainpatientswithdiarrhea课题来源：自选课题学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员罗敏红俞守义教授流行病与卫生统计学学术型硕士研究生公共卫生与热带医学院杨翌教授曾年华研究员陈青山副教授陈清教授胡贵方教授2013年5月30日广州I

2、IIIIIIIlUllllllllllllllllllllllllllllllllUlllY2405796硕士学位论文建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中的小肠结肠炎耶尔森菌硕士研究生：罗敏红指导教师：俞守义教授陈清教授摘要研究背景：小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica，yenterocolitica)，是近20世纪80年代以来引起国际上广泛关注的一种重要的感染性腹泻致病菌，于1933年在美国纽约州发现后，曾引起数次大规模的胃肠道内或和胃肠道外感染爆发。上个世纪80年代中期，我国曾发生2次大爆发，造成500多人感染

3、。小肠结肠炎耶尔森菌是一种全球分布的食源性病原菌，可引起人类多种肠道症状，如腹泻、肠炎、肠系膜淋巴结炎以及末端回肠炎，以自限性疾病为主；还可通过淋巴系统播散，引起一系列肠道外并发症状，包括反应性关节炎、结节性红斑、心内膜炎，败血症等，不仅对人类身体健康产生较大危害，也严重影响了公共卫生，给人类以及社会带来较大的经济以及医疗负担。目前国内医院尚未把小肠结肠炎耶尔森菌列入常规的检测项目中，医务人员普遍缺乏对本菌的认识，临床医生在对胃肠道疾病进行诊断时也很少考虑小肠结肠炎耶尔森菌的感染，人们可能低估了该菌感染的真实情况。目前普遍用于小肠结肠炎耶尔森

4、菌检测的方法有传统的细菌分离培养和生化鉴定、普通PCR法、Real．timePCR法等。传统的分离培养和生化鉴定对污染T中文摘要样本进行检测时都需要经过前期的增菌，然后再进行分离培养和十几项的生化鉴定，而该菌的致病数量低，培养增殖缓慢，分离成功率低，敏感性不高，耗时耗力，还可能耽误临床感染患者抗生素的使用。以PCR法为基础的核酸扩增技术则需要昂贵的实验设备，较高的检测费用、结果判断繁琐，对检测人员技术要求较高等，这些特点使其不适用于现场快速检测和基层单位推广普及使用。寻找一种新的快速、简便、廉价的检测方法成为研究的热点。环介导等温扩增(100

5、p．mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是近十年来发展起来的一种新型的敏感、特异、方便快捷的体外恒温链置换基因扩增技术，针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下，特异、高效、快速地进行扩增，1小时内扩增效率可达到109．1010拷贝的数量级，终点产物检测通过肉眼观察即可。由于其经济、快速、实用而逐步应用在生命科学的各个领域如：病原体及其耐药性诊断、基因诊断与治疗、胚胎性别鉴定、食品卫生检验和环境监测等。可作为病原体所致疾病早期检测和鉴定的一种简单而快速的诊

6、断方法，在对条件较差的基层单位，现场，战时野外环境，灾后地区病原体的现场快速检测有着广阔的应用前景。此外，查阅文献发现，现有研究中绝大多数学者在进行LAMP条件优化试验时，习惯性地对试验体系的影响因素进行逐一单因素优化，繁琐费时，存在较大的盲目性，而且得到的单因素最佳扩增效果组合在一起不一定是最佳的反应组合。有学者利用正交设计进行LAMP反应条件优化，正交设计能成倍地减少试验次数，但是也要注意，正交设计之所以能成倍减少试验次数，是以牺牲分析各因素的部分或大部分交互作用为代价的，且正交设计表设计较为麻烦。析因设计(也称全因子实验设计)，即实验中

7、涉及所有因素及所有水平全面组合形成实验条件，各实验条件下至少做2次独立重复实验。析因设计是对各因素不同水平的全部组合，故具有全面性和均衡性。析因设计的最大优点是所获得的信息量很多，可以准确地估计各实验因素的主效应的大小，还可估计因素之间各级交互作用效应的大小。自从著名的英国统计学家Fisher于20世纪30年代创立析因设计并首次将其应用在农业试验中，试验设计方法至今已经得硕士学位论文到了充分的发展和广泛的应用，在工业、医药以及科学实验等各个方面均有其踪迹。研究目的1．建立粪便样本中的小肠结肠炎耶尔森菌的LAMP检测方法，将析因设计引入LAMP

8、反应的条件优化试验中，并对影响LAMP反应的主要因素作进一步分析；2．对优化后确定的LAMP最佳反应体系进行特异度和灵敏度等指标的测试，并将其应用于临床腹泻样本的实