华蟾素对h22肝癌细胞诱导免疫细胞合成释放β-end的影响

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1、分类号R96密级公开UDC硕士学位论文华蟾素对H22肝癌细胞诱导免疫细胞合成释放β-END的影响学位申请人：詹玲学科专业：药理学指导教师：陈涛教授二○一三年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineTheeffectofCinobufotalinonH22Hepatomacellinduceimmunecelltosynthesisandreleaseβ-ENDinintr

2、oGraduateStudent:ZhanLingMajor:PharmacologySupervisor:Prof.ChenTaoChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2013三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识

3、到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者

4、签名：日期：I内容摘要目的：建立小鼠脾淋巴细胞和小鼠H22肝癌细胞体外共培养模型，使用华蟾素干预共培养模型，观察上清液中β-END和细胞因子CRF含量，检测免疫细胞内POMC和CTSL的基因表达，探索华蟾素对免疫细胞的增殖促进作用和趋化作用。从而为华蟾素从β-END-μ-POMC途径治疗癌痛的机制研究提供理论依据。方法：(1)提取小鼠脾淋巴细胞，制备小鼠H22肝癌腹水细胞，体外将两种细胞按照一定浓度比共培养。(2)ELISA法测定华蟾素促进免疫细胞释放β-END的含量来选择测定指标的最佳时间以及共培养的最佳浓度

5、比。ELISA法测定华蟾素对共培养模型上清液中细胞因子含量的影响。(3)MTT法和细胞计数法比较华蟾素对免疫细胞和肝癌细胞生长情况的影响。(4)荧光定量PCR检测免疫细胞中POMC和CTSL的基因表达水平。(5)Transwell趋化实验测定华蟾素对免疫细胞的趋化作用。结果：(1)成功建立小鼠脾淋巴细胞和H22肝癌腹水细胞的体外共培养模型。(2)根据华蟾素促进免疫细胞释放β-END的含量选择测定指标的最佳共培养时间为24h，脾淋巴细胞和H22肝癌细胞的最佳浓度比为10:1。且不同浓度华蟾素均能显著性地增加共培养

6、模型上清液中β-END的含量(P<0.01)。(3)不同浓度的华蟾素均能明显促进免疫细胞以及共培养后的免疫细胞的增殖，与空白对照组相比，二者在24h、48h均具有显著性统计学差异(P<0.01)。不同浓度的华蟾素对H22肝癌细胞和共培养后的H22肝癌细胞均有抑制作用(P<0.01)。(4)荧光定量PCR检测华蟾素1/40能够显著促进免疫细胞中POMC和CTSL的基因表达水平，与对照组相比，具有显著性统计学差异(P<0.01)。(5)Transwell趋化实验测定华蟾素对免疫细胞有明显的趋化作用。结论：在体外的小

7、鼠脾淋巴细胞和H22肝癌细胞共培养模型中，华蟾素能够促进共培养上清液β-END和细胞因子CRF的含量，增加β-END的前体蛋白POMC和CTSL的基因表达水平。华蟾素能够抑制肝癌细胞的同时促进免疫细胞的增殖作用和趋化作用。推测华蟾素可能通过提高β-END的合成和释放，并且促进免疫细胞的增殖和募集，从β-END-μ-POMC途径发挥局部镇痛作用。关键词：华蟾素共培养免疫细胞趋化作用β-ENDIIAbstractObjectiveInthisstudy,weestablishedtheco-culturemodel

8、ofspleniclymphocyteandH22hepatomacarcinomacellinmiceinvitro.WeobservedthatwhetherCinobufotalincanpromotethereleaseofβ-ENDinsupernateandtheexpressionofCRF、IL-1andthegeneexpressionofPOMCandCTSL.To