raav2-hbmp-7对人牙髓细胞分化地影响

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1、中山人学硕士学位论文rAAV2一hBMP一7对人牙髓细胞分化的影响rAAV2．hBMP．7对人牙髓细胞分化的影响专业：口腔临床医学研究生：朱海燕导师：林正梅主任医师中文摘要BMP．7(bonemorphogeneticprotein．7，BMP．7)是1990年克隆得到的骨细胞因子，能诱导间充质细胞向软骨细胞、成骨细胞分化，异位诱导软骨和骨的形成。研究表明BMP．7能促进牙髓细胞分化，诱导修复性牙本质形成，是一种良好的、促进牙本质再生的生物盖髓剂。但BMPs生物半衰期短、降解速度快、在缺损区难保持足够时间的生物活性，限制其在临床

2、中的应用。因此如何能使BMPs持续、适量地释放是目前亟待解决的关键问题。基因治疗为BMPs的应用提供新的思路。本课题组前期研究曾将腺病毒(adenovirus，Ad)作为BMP．7载体转入人牙髓细胞(humandentalpulpcells，hDPCs)，发现转染后的hDPCs能成功表达BMP．7蛋白并能诱导hDPCs分化。然而Ad载体在表达目的蛋白的同时表达病毒衣壳蛋白，引发机体的炎症和免疫应答，其安全性成为人们担忧的隐患。腺相关病毒(adeno．associatedvirus，AAV)以其免疫原性小、安全性好、无致病性等优点

3、成为基因治疗的新型载体，逐渐受到学者的关注。AAV载体己广泛用于各种组织的基因治疗，如骨组织、心肌组织等。目前已发现的AAV至少有8种，其中最常用的类型有AAV2型与AAV2／1型。不同类型的AAV由于衣壳蛋白的不同对细胞具有不同的亲和性。AAV2与AAV2／1中哪种类型更适合hDPCs的基因治疗，目前无相关研究报道。本实验分别将带有绿色荧光蛋白基因的rAAV载体(recombinantadeno-associatedvirus-mediatedenhancedgreenfluorescentprotein，rAAV-EGFP)

4、rAAV2-EGFP、rAAV2／I．EGFP转染hDPCs，通过比较两者在hDPCs中的转染效率，选择较合适载体；构建带有目的基因hBMP．7的AAV载体，转入hDPCs，Westernblot检测转染后hDPCshBMP．7的表达；观察rAAV-hBMP一7转染后hDPCs的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性以及牙本质涎磷蛋白(dentinsialoprotein，DSPP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)mRNA表达，探讨中山入学硕十学位论文rAAV2．hBMP．7对人牙髓细胞分化的

5、影响rAAV．hBMP．7转染对hDPCs分化的调节作用，为活髓保存的基因治疗提供实验基础。目的：比较rAAV2一EGFP和rAAV2／1．EGFP对hDPCs的转染效率及病毒转染对hDPCs的毒性，筛选转染hDPCs的较合适载体；构建rAAV．hBMP．7并制备重组病毒液；检测经rAAV．hBMP．7转染后hDPCshBMP．7蛋白的表达，研究hBMP．7基因转染对hDPCs分化的调节作用，为进一步开展活髓保存治疗的体外及临床研究提供实验依据。研究方法：①采用酶消化组织块法培养hDPCs并鉴定组织来源；②将rAAV2．EGFP

6、、rAAV2／1．EGFP按感染复数(multipleofinfection，MOI)104、105、5x105转染第2代hDPCs，转染后48h免疫荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白表达情况，确定rAAV转染llDPCs的最适MOI值；流式细胞仪检测转染后7drAAV2．EGFP和rAAV2／1．EGFP在hDPCs中的转染效率；MTT法检测rAAV2．EGFP、rAAV2／1．EGFP按最适MOI值转染hDPCs后4d、6d、8d、10d、12d的增殖活性；③构建rAAV-hBMP．7载体；@Westemblot检测rAAV-h

7、BMP．7转染后7d、14d和21dhDPCs中hBMP．7蛋白的表达；⑤碱性磷酸酶活性检测与茜素红矿化结节染色检测rAAV-hBMP．7转染后hDPCs体外矿化能力；Realtime．PCR检测DSPP、OCNmRNA的表达，观察rAAV-hBMP．7转染后hDPCs分化的生物学特性。结果：①酶消化组织块法可有效进行hDPCs的原代培养。免疫细胞化学显示所获得的细胞均为抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性；②rAAV2．EGFP、rAAV2／I．EGFP转染hDPCs后48h荧光显微镜下观察，EGFP的表达数随着MOI值的增

8、加而增高，当MOI值为104，105，5×105时rAAV2．EGFP转染hDPCs48h的转染率分别为(42．33±3．42)％、(67．58±0．99)％、(73．46±1．36)％；rAAV2／1．EGFP转染转染率分别为(13．63±0．91)％、(34