论文资料-苹果酸脱氢酶基因克隆表达硕士论文

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3、7第一章绪论7-131.1苹果酸脱氢酶的理化性质和生物功能7-81.2苹果酸脱氢酶的用途81.3酶活力的影响因素8-91.4重组蛋白在大肠杆菌pET系统中的表达9-101.5耐热酶天然构象的耐热机制10-121.5.1氨基酸组成10-111.5.2疏水作用111.5.3氢键111.5.4离子网状结构11-121.6苹果酸脱氢酶的热稳定性121.7本课题的立题意义及其内容12-13第二章实验材料和方法13-222.1实验材料13-142.1.1实验仪器132.1.2实验材料13-142.2实验方法14-222.2.1大肠杆菌(Escheric

4、hiacoli)JM109染色体的提取142.2.2PCR引物的设计14-152.2.3苹果酸脱氢酶编码基因的扩增体系及条件152.2.4PCR产物与克隆载体pMD18-T的连接152.2.5重组质粒pET-28a-mdh的构建152.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备15-162.2.7转化大肠杆菌BL21感受态细胞162.2.8重组质粒的提取及酶切验证162.2.9苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中的诱导表达162.2.10粗酶液的制备162.2.11Ni-NTA纯化粗酶液16-172.2.12SDS-PAGE172.2.13苹果酸脱氢酶的酶活测定1

5、72.2.14蛋白含量的测定172.2.15苹果酸脱氢酶的酶学性质17-182.2.16苹果酸脱氢酶的分泌表达18-192.2.17苹果酸脱氢酶热稳定性的定点改造19-22第三章结果与讨论22-373.1大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因的克隆表达、纯化和酶学性质研究22-273.1.1重组质粒pET-28a-mdh的构建及其结果223.1.2大肠杆菌苹果酸脱氢酶(MDH)诱导表达及纯化结果22-233.1.3苹果酸脱氢酶的酶学性质23-273.2大肠杆菌苹果酸脱氢酶分泌表达结果分析27-293.2.1重组质粒pET-22b-mdh的构建及酶切验证2

6、73.2.2重组菌pET-22b-mdh/BL21的诱导表达及SDS-PAGE分析27-283.2.3分泌表达的苹果酸脱氢酶比酶活的测定及结果分析28-293.3苹果酸脱氢酶热稳定性的定点改造29-353.3.1苹果酸脱氢酶基因mdh定点突变的位点293.3.2重叠延伸PCR的结果分析29-303.3.3重组质粒pET-28a-mdh(L225K、Q229E、D45E)的构建及酶切验证30-323.3.4重组质粒pET-28a-mdh(L225K、Q229E、D45E)在大肠杆菌BL21中的诱导表达及SDS-PAGE验证32-343.3.5

7、定点突变后的苹果酸脱氢酶最适温度的比较结果343.3.6定点改造后的苹果酸脱氢酶热稳定性比较34-353.3.7定点突变后苹果酸脱氢酶热稳定性提高位点的氨基酸分析353.4小结35-37第四章结论与展望37-384.1结论374.2展望37-38致谢学科专业名称】微生物学【学位年度】2010【论文级别】硕士【关键词】苹果酸脱氢酶;克隆表达;酶学性质;分泌表达;定点突变;【英文关键词】malatedehydrogenase;cloningandexpression;characterization;secretedexpression;sit

8、e-directedmutagenesis;【中文摘要】苹果酸脱氢酶(MDH)是三羧酸循环中的一个关键酶,在生物体内普遍存在,MDH以NADH或NAD+为辅因子,催化苹果酸盐与草