i型成纤维细胞生长因子受体(fgfr1)在腭发育中的作用机制研究

《i型成纤维细胞生长因子受体(fgfr1)在腭发育中的作用机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、论文题目：I型成纤维细胞生长因子受体(FGFRl)在腭发育中的作用机制研究答辩委员会主席：王奋教授德州农工大学健康研究中心答辩委员会成员：姓名职称单位钟惟德王晓英胡荣党林绍强教授广州医学院附属广州市第一人民医院教授哈佛大学医学院麻省总院教授温州医科大学口腔医学院教授温州医科大学药学院目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IV前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1目q舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．1实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2组织培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．4主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32主要试剂配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73．1动物繁殖及胚胎样品收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，73．2PCR反应

3、检测胚胎样品DNA基因型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．“3．3胚胎组织石蜡包埋⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．133．4H&E染色观察胚胎腭突形态⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。．133．5X—gal染色检测Cre阳性细胞表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．133．6B姗法检测细胞增殖⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133．7免疫荧光染色检测细胞特异性蛋白表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．143．8原位杂交分析组织基因表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯153．9胚胎腭突体外培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．163．10Triz01法提取组织RNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．163。llT

4、UNEL法检测细胞凋亡⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．12实时定量RT-PCR分析基因表达水平⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．11．1RNA反转录为cDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．11．2荧光定量PCR反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．183．13统计学处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l1．神经嵴细胞(NCC)中缈J『敲除导致腭裂的产生⋯⋯⋯．．212．NCC中缈J『敲除引起腭发育过程中腭突上抬受损⋯⋯⋯．273。硒J敲除不影响颅神经嵴(CNC)细胞参与腭板

5、形成⋯⋯324．彤J『。肋胚胎腭突细胞增殖缺陷及MEE细胞凋亡变化⋯⋯．385．CNC细胞来源间质缈J『敲除影响腭突MEE退化⋯⋯⋯⋯426．NCC中聊j敲除影响额面部细胞信号通路⋯⋯⋯⋯⋯⋯50分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64英文缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯75综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯76参

6、考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯86独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．95温州医学院博士学位论文中文摘要目的FGF对于腭形成极为重要，通过激活FGFR酪氨酸激酶调节着腭的发育。FGF和FGFR基因的突变都与腭裂相关。FGF信号在腭发育中的多种机制研究主要集中在上皮FGFR2，尽管FGFRl在腭间质表达且愿痧J突变与腭裂相关，但是对神经嵴细胞来源的间质FGFRl如何调节腭形成并不是非常清楚。本课题通过特异性敲除神经嵴细胞母汐』，以此来研究FGFRl在腭发育和腭裂形成中的重要作用机制。方法1．WntlC,e转基因小鼠与

7、FgfrFq。x小鼠交配，获得不同胚胎时期组织样品进行基因型检测。选择带有ROSA26报告基因的E1O．5胚胎组织进行LacZ染色，比较野生型和彤J『敲除组早期额鼻突、上颌突和下颌突细胞生长变化。2．选择E13．5，E14．5，E15．5各个时间点对照组和缈，敲除组胚胎进行H&E染色，观察不同时期腭突形态的变化。同时对E12．5、E13．5和E14．5组织进行细胞增殖检测，分析不同时期腭突上皮细胞和间质细胞表现。应用TUNEL试剂盒来分析腭突细胞凋亡的改变。由于胁rJc”是在神经嵴细胞特异性表达，X-gal染色以此来判断腭突细胞来源。同时检测V毗ntm

8、在对照组和彤J彻组腭突细胞中的表达。3．分离E13．5天胚胎腭突，在8gm孔径过滤膜上相互靠近