利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制

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分类号密级华中农业大学硕士学位论文利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制GENETICANALySISOFSHEATHBLIGHTRESISTANCEUSINGTHEINTRoGRESSIONLINES研究生：党慧指导教师：罗利军研究员陈亮研究员指导小组：罗利军梅捍卫刘灶长陈亮余舜武刘鸿艳研究员副研究员专业：作物遗传育种研究方向：水稻分子生物学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2013年6月华中农业大学植物科技学院二。一三年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文7R如需保密，解密时间年月曰口是否保密枞胡一J㈣嬲本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。也不包舍为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证--B而使用过的材料。指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：t龀惹时间：z。f弓年箩月27日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷版和电子版。并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书。学位论文作者签名：屹惫、导师签名：r黼f签名日期：矽乃年箩月z7日签名日期：沙／多年岁1月呷日 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．I。』旧STRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．III缩略名词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．V1文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1水稻纹枯病病原菌生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2水稻纹枯病的发生及病害循环⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．3水稻纹枯病的田间接种鉴定体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3．1接种方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．3．2评价标准⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．4水稻纹枯病的抗源筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．4．1发掘创制水稻抗纹枯病育种新种质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．4．2深水稻抗纹枯病基因资源的挖掘⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．4．3野生稻抗纹枯病基因资源的挖掘⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．5水稻纹枯病的遗传研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．5．1水稻纹枯病抗性基因的定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．5．2全基因组测序法寻找候选基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．6本研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72利导入系分析水稻纹枯病抗性位点和效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．1．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．1．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．1．2．1田间试验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．1．2．2水稻纹枯病菌接种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。82．1．2．3抗病相关性状考察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．1．2．4病情评价标准⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．1．3表型数据统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102．1．4亲本多态性检测、群体基因型分析和遗传图谱构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一102．1．4．1DNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．4．2亲本多态性筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102。1。4．4遗传连锁图谱的构建和QTL分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102．2结果和分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．112．2．1表型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2．2．1．1亲本和群体的表型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．112．2．1．2三个环境下导入系群体中各性状的方差分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．2．1．3抗性指标之间的相关性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2．2基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．2．3水稻纹枯病抗性QTLs分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2l2．2．3．1水稻纹枯病抗性主效QTLs分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．212．2．3．1水稻纹枯病抗性互作QTLs分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2l2．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．3．1C418导入系的改良分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．3．2水稻纹枯病抗性QTLs分布及其利用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223水稻优异种质资源的纹枯病抗性鉴定与评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一243．1．I材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．1．2抗病性评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2结果和分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．243．2．1重复鉴定的稳定性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2．2抗病指标和农艺性状的相关性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2．3纹枯病抗性鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283．3．1水稻纹枯病抗性影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．3．2抗病资源筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37附录I植物DNA提取步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37附录I．1大样法(改良CTAB法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37附录I．2小样法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37附录IISSR反应体系和扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38附录Ⅲ电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38附录IⅡ．1琼脂糖电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38附录IⅡ．2PAGE电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38附录IVC418导入系基因型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4lII 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制摘要水稻是我国主要的粮食作物之一，常年播种面积4．5亿亩，水稻纹枯病在全国大部分稻区偏重发生，一直严重地影响着水稻生产。了解水稻抗病遗传机理、选育抗病品种是防治病害的有效办法。本研究通过对C418导入系群体进行抗病表型鉴定和分子标记作图，定位水稻抗纹枯病QTL；对中国水稻微核心种质和抗旱核心种质进行纹枯病抗性鉴定和评价。主要研究结果如下：1．选用来自辽宁农科院的一个优良水稻品种C418做轮回亲本，分别与四个供体亲本BR24、Cisanggarung、Dhan4、滇屯502做杂交，构建了包含269个株系的回交导入系群体。本研究对BC2F4、BC2F5、BC2F6代分别进行了水稻纹枯病的抗性鉴定，病菌接种采用牙签嵌入的方法，鉴定指标包括株高、病斑高、相对病斑高和病级。2．2011年在上海(E1)和海南(E2)以及2012年在上海(E3)分别对亲本及导入系群体进行纹枯病田间接种和抗性表型鉴定。三个环境中检测到BR24、Cisanggarung、Dhan4、滇屯502和C418的病级平均值分别为5．3、6．3、6．3、6．O和7．3，表明4个供体亲本的抗性均显著高于C418。导入系群体的纹枯病抗性水平呈现连续的正态分布。3．构建了一张包含150个SSR分子标记的水稻遗传连锁图，总图距2348．64cM，标记均匀分布于水稻的12条染色体上，标记间的平均距离15．65cM。四个导入系群体中供体亲本基因的平均导入频率为9．2％～11．O％，符合理论预测范围；轮回亲本基因组的评价背景回复率为89．10／旷95．9％，表明导入系的遗传背景基本与轮回亲本接近。4．三个环境下，C418导入系群体中共检测到和株高、病斑高、相对病斑高、病级相关的21个主效QTLs，同时检测到和病斑高、相对病斑高、病级相关的26对互作QTLs，抗病等位基因多来自于供体亲本，四个导入系群体所检测的QTL位点互不重叠，推测四个供体亲本含有不同的有利等位基因。控制病斑高、相对病斑高和病级的QTL定位于相同的染色体区域，形成6个QTL富集区，分别为第1染色体的RM5310标记附近、第2染色体的RM341标记附近、第3染色体的RM523标记附近和RM6914标记附近、第7染色体的RMl80标记附近、第12染色体的RM519标记附近，这些QTL富集的区域为抗病候选基因的精细定位和图位克隆提供了有效的参考区域。 兰!奎些奎兰!竺!!壁婴主竺圣竺堂焦笙茎5．2011年在上海(E1)和海南(E2)以及2012年在上海(E3)分别对181份中国水稻微核心种质、107份抗旱核心种质和56份纹枯病抗感差异材料进行了两年三点的纹枯病抗性鉴定和评价。检测到抗病品种10份，占供试材料的比例2．9％；中抗品种82份，比例23．8％；中感品种161份，比例46．8％；感病品种54份，所占比例15．7％1高感品种10份，比例10．8％。本次实验中未发现高抗品种，其中中度感病品种最多，所占比例接近供试品种的一半。关键词：水稻纹枯病；导入系；数量性状位点；病级；SSR标记 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制AbstractRiceisoneofthemajorgraincrops"inChinaandwithaplantareaof450millionmu．Thesheathblightdiseaseoftenoccurandleadstoagreatlossofriceyieldandquality．Understandingthegeneticmechanismofthediseaseandcultivationofdisease-resistantvarietiesarepossibleeffectivecontrolmethodsinthefuture．Inthisstudy，phenotypicofsheathblightresistanceWasidentifiedandgenotypeoftheC418introgressionlineswereanalysedforQTLmapping．Amini-corecollectionofChinesegermplasmofriceandacorecollectionofdrought—resistantgermplasmwerealsoidentifiedandevaluatedforresistancetoricesheathblight．Themainresultsofthestudywere：1．ABC2F3introgressionlinesconsistingof269individualsweredevelopedbycrossingandbackcrossing，inwhichamajorhybridrestorerlinesC418Wasusedasrecurrentparent，BR24，Cisanggurang，Dhan4andDiantun502wereusedasdonorparents．TheBC2F4，BC2F5，BC2F6populationwereinoculatedusingtoothpickimbeddingmethod，thenplantheight(PH)，lesionheight(LH)，relativelesionheight(RLH)anddiseaserate(DR)wererecordforsheathblightresistanceevaluation．2．TheevaluationofdiseaseresistanceoftheintrogressionlinesandparentswerecarriedoutatShanghaiin20110s1)，atHainanin201l(E2)，atShanghaiin2012(E3)，respectively．TheaveragevaluesofDRforBR24，Cisanggurang，Dhan4，Diantun502andC418were5．3，6．3，6．3，6．0and7．0，respectively．TheresultsindicatedthattheresistancelevelofdonorparentsWashigherthanthatofC418．Otherdiseaserelatedtraitshavethesamephenotypicvalues．3．AgeneticlinkagemapWasconstructedbasedontheintrogressionlinesusing163SSRmarkerscoveringall12chromosomes，whichcoveredatotalof2348．64cMwithallaverageintervalof15．65cMbetweenadjacentmarkers．ThedonoraUelic丘equenciesinthefourintrogressionlineswere9．2％～11．0％，inthescopeoftheoreticalpredictions．Thereplacementrateofthefoursinglesegmentsubstitutionlineswere89．1％-95．9％，makingsurethatthegeneticbackgroundoftheintrogressionlinesaresimilartorecurrentparentC418．4．Atotalof21main—effectQTLsand26epistaticQTLsaffectingsheathblightresistancewereindentifiedinthreeenvironmentsandtheresistantalleleofmostQTLs 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文camefromdonors．TheQTLsdetecteddidnotoverlap，indicatingthatthefourdonorscontaindifferentfavorablealleles．SomeQTLsforlesionheight，relmivelesionheight，diseaseratewerelocatedinthesamechromosomeregions，forming6multipleQTL—richregions，theyaremarkerRM5310onchromosome1，markerRM341onchromosome2，markerI{-M523andmarkerI乏M69l4onchromosome3，markerRM180onchromosome7andmarkerRM519onchromosome12．TheseQTL—richregionshavegivenasubsetofefficientchromosomeregionsforfinemappingandmap—basedcloneofgenesforricesheathblightresistance．5．Fromthemini-corecollectionofChinesegermplasmofrice(181varieties)，corecollectionofdrought-resistantgermplasm(107varieties)，resistantandsusceptiblematerials(56varieties)wereidentifiedandevaluatedforresistancetoricesheathblightusingartificialinoculationmethodsatShanghaiin201I(E1)，atHainanin2011(E2)，atShanghaiin2012(E3)，respectively．Thenumbersofresistant，moderatelyresistant，moderatelysusceptible，susceptibleandhighlysusceptiblegermplasmwere4，82，161，54，10，andthepercentagewere2．9％，23．8％，46．8％，15．7％，10．8％，respectively．Accordingtothisstudy，nohighlyresistantgermplasmhavebeenfoundwhilethemoderatelysusceptiblegermplasmhadthehighestnumbers，almosthalfofthetotal．Keywords：Ricesheathblight；Introgressionlines；Quantitativetraitlocus(QTLs)；Diseaserate；SSRmarkerIV 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制缩略名词表缩略词中文名英文名(单位)垒垒垒坠堡塾垫!塑垦翌g坐坠f竺坠i垒A加性效应AdditiveeffectAA加加互作Additive×additiveepistasisAAE上位性与环境互作Epistasis×environmentinteractionAE加性与环境互作Additive×environmentinteractionAP过硫酸铵AmmoniumpersulfateIL导入系introgressionlinesCTAB十六烷基三甲基溴化铵HexadecyltrimethylammoniumBromideDNA脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicacidDR病级DiseaserateHD抽穗期Headingdate(days)LH病斑高度Lesionheigth(cm)LOD机率的常用对数值LogofoddPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresisPCR聚合酶链式反应PolymeraseChainReactionPDA马铃薯葡萄糖琼脂PotatodextroseagarPH株高Plantheight(cm)QxEQTL与环境互作QTL×environmentinteractionQTL数量性状位点QuantitativetraitlocusRLH相对病斑高Relativelesionheigth(％)SF结实率Spikeletfertilitypercentage(％)SSR微卫星标记SinglesequencerepeatTEMEDN，N，N’，N’·四甲基二乙胺N，N,N’，N’．TetramethylethylenediamineTGW千粒重1000．grainweight(g)V 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制1文献综述水稻纹枯病又称云纹病，俗名花足秆、烂脚瘟、眉目斑。目前水稻纹枯病在亚、非、欧、美各洲水稻种植国家普遍发生，成为一种世界性病害。我国各水稻产区均有分布，长江以南稻区危害较重，是当前水稻生产上的主要病害之一。纹枯病菌适宜在高温高湿环境下发生和流行，该病使水稻不能抽穗，或抽穗的秕谷较多，引起结实率和千粒重显著降低，甚至导致植株倒伏枯死。早、中、晚稻皆可发生，苗期至穗期都可发病，矮秆品种受害更重。1．1病原菌生物学特点Thanatephoruscucumeris(Frank)Donk．称瓜亡革菌，属塑壬萱亚[]真菌。无性态RhizoctoniasolaniKahn称立枯丝核菌，属半知菌亚门真菌。水稻纹枯病的致病菌为立枯丝核菌(ThanatephoruscucumerisDonk)，有性态称瓜亡革菌，担子菌亚门亡革菌属；病原菌无性阶段为茄丝核菌(RhizoctoniasolaniK谢hn)，半知菌亚门丝核菌属。菌落色泽浅褐色或灰褐色，菌丝幼嫩时无色，老熟时灰褐色，较粗壮，有分枝，菌丝生长的温度范围是10．36℃，最适温度是28．32℃；老熟的菌丝可形成菌核，菌核深褐色，圆形或近圆形，较紧密，相互聚集，一般生于气生菌丝丛中，菌核适应性强，可以在土壤中越冬，环境适宜时可以萌发进行再侵染。1．2病原菌学研究纹枯病菌主要以其无性世代对农作物造成危害，该病菌寄主范围广，又具有多核、杂合、强腐生性、有性生殖退化等特点，病原机理和生物学特性复杂。迄今为止，国际上已确认18个立枯丝核菌种内菌丝融合群，通过对ITS序列以及5．8srDNA序列的分析，对立枯丝核菌18种菌丝融合群进行归类，分析出各菌的亲缘关系的远近(Current等1997)；立枯丝核菌毒素可引起水稻纹枯病的典型症状，还能抑制胚根胚芽的伸长、致萎水稻幼苗、降低植株中叶绿素的含量(徐敬友等2004)；立枯丝核菌的致病因子果胶酶、胞壁降解酶能使寄主的细胞壁变薄、细胞膜通透性改变，导致胞内电解质外渗、细胞器消解(陈夕军等2009)；随着第二代测序技术的广泛应用，对足SolaniAGlIA进行全基因组测序，组装出的全基因组框架图为37M，其中注释到致病因子数据库中的基因257个，包括水解酶、吲哚类生物碱、次生代谢产物、合成酶以及相关的转运蛋白等，研究表明纹枯病病原菌具有独特的致病因●‘1 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文子；比较基因组发现，立枯丝核菌含有特殊的功能蛋白基因家族和致病基因家族；通过分析寄主被病原菌侵染后在不同时期的基因表达，发现了致病因子的侵染模式，一些和致病相关的功能基因得到初步预测(郑爱萍等2013)。1．3水稻纹枯病的接种鉴定方法1。3。1接种方法纹枯病的接种方法有灵活多样，可根据研究需要和实验计划而定。总体而言，水稻纹枯病的接种一要操作方便，二是要保证相对一致的接菌量和发病环境，三要在水稻易感纹枯病的生育阶段进行。近年来报道的水稻纹枯病接种方法主要涉及以下几种：撒施法：用稻谷与谷壳1：2的混合物装入大锥形瓶中，灭菌后接种病原菌，保持瓶内湿润，培养约3．7d待接种物上布满菌丝和菌核时，撒施于分蘖末期的稻丛基部(Rush等1976)；注射法：病原菌在PSA培养基上28℃培养48h，除去菌核，然后将菌丝和培养基打碎成乳状液体，用注射器将0．25ml菌液注入孕穗期的水稻叶鞘内(Wasano等1983)；牙签法：是目前研究采用最多的一种方法，将长约lcm的牙签或木制短棒灭菌后均匀铺撒在PDA培养基上，接菌培养3～7d，接种时用镊子将牙签自上而下嵌入分蘖末期水稻的倒三叶叶鞘内(潘学彪等1997)；温室苗期接种法：是微室苗期快速接种鉴定常用的方法，将直径7mm的菌丝块或带菌稻谷撒施于4～5叶期的水稻苗基部，或将直径2mm的菌核嵌入6～7叶期水稻苗的倒二叶叶鞘内(Sin曲等2002)；上述方法中，撒施法操作简单、省工省时、成本低，由于带菌量不好控制，常做为一种初步筛选抗病材料的方法；注射法能显著降低田间环境的影响、可控性高、结果准确，缺点是程序比较复杂、操作细节不好把握，适宜于进行准确鉴定的遗传研究；牙签法能保证接菌量一致、操作性强、重复性好，缺点是工作量大，不过在目前的水稻纹枯病遗传研究中应用最广；温室苗期接种鉴定法具有发病环境可控，鉴定周期短等优点，近年来被一些学者相继采用，同时温室苗期接种法也存在着一些缺点，如：实验规模小、资源设备消耗大、苗期品种长势间的差异影响发病程度等。2 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制1．3．2评价标准理论上讲水稻处于拔节期至抽穗期时，植株生长旺盛，防御机制相对较弱，此时病菌扩展最快，待抽穗25～30d以后，水稻植株开始老化，不再利于病菌的蔓延，病情达到稳定。潘学彪对感病品种Lemont、抗病品种特青和Jmsmine85进行接种鉴定，表明植株在拔节至抽穗前后生长明显不齐，抗感不易识别；抽穗后30d病情发展已基本稳定，可进行抗性鉴定(潘学彪1997)。目前这种调查方法已被广泛采用(郑天清等，2007；谢学文等，2008：Sharmaetal，2009；Channamallikarjunaetal，2010；高晓清等，2011；Wangetal，2012；刘毅等，2013)。抗病鉴定方法是抗病遗传育种的关键环节，水稻纹枯病被视为一种典型的叶鞘病害，Rush提出了水稻叶鞘的受害程度的0-9级病情评价体系，主要考虑病斑达到的高度，此法具有一定的操作难度(Rush1976)；潘学彪提出相对病斑高的概念，并作为水稻纹枯病的抗性评价指标之一(潘学彪等1999)；左示敏对Rush的O~9级病情评价标准进行了改进，改进后各级别的总体划分基本相似，标准更简洁，操作更方便，此法满足病情划分和精细定位的要求，为水稻纹枯病的抗性鉴定提供了方法依据(左示敏等2006)。1．4水稻纹枯病的抗源筛选水稻纹枯病的研究比稻瘟病和白叶枯病研究落后许多。目前还没有发现对纹枯病完全免疫的品种，研究发现，不同水稻品种的抗病水平是有差异的，虽未能发现对纹枯病完全免疫的水稻品种，不可否认大多数水稻品种中存在着纹枯病的优异抗源。1．4．1发掘利用水稻抗纹枯病育种新种质潘学彪对68份水稻品种进行了水稻纹枯病的田间接种鉴定，不同材料的抗性差异达到了极显著水平，按照抗病水平为基础把供试材料做了个聚类分析，共聚为6大类，鉴于抗病基因是可遗传的，应用到育种实践中或许能达到定向改良水稻抗纹枯病的效果(潘学彪等2001)；袁筱萍进行了9个水稻品种、3种菌株、2种接种方法、2个生长季的纹枯病鉴定实验，检测到籼稻品种白叶秋的纹枯病的抗性高且重复性好，建议用于抗病育种(袁筱萍等2004)；张楷正鉴定了南方稻区主要亲本的水稻纹枯病抗性，结果表明，17个供试材料中，抗病亲本3个(蜀恢527、明恢63、广 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文恢128)，中抗亲本3个(协青早B、绵恢725、珍汕97B)(张楷正等2008)；刘毅针对295份水稻微核心材料以及全球水稻分子育种计划的亲本材料做了纹枯病的抗性评价和分析，其中BR24、Hnankar、解放籼、秕五升、赤壳糯、红旗5号、泽谷、寸谷糯和旱麻稻达中抗水平；SmBUI_也AO、Gizal4和香稻达抗病水平(刘毅等2013)。1．4．2深水稻抗纹枯病基因资源的挖掘深水稻是籼稻的一个亚种，属于禾本科稻属粮食作物，一般生长在深水中，有较强的感光性，生长条件取决于水位、光照和土壤等因素。胡春锦报道了对12个深水稻品种进行盆栽接种鉴定和农艺性状调查，发现大多数深水稻品种的纹枯病抗性在抗与中抗之间，个别品种表型出较高的抗病水平，表明优良抗源还是存在的(胡春锦等2003)；陆岗研究了深水稻品种的纹枯病抗性，12份来源于中国广西和南亚部分国家的深水稻品种经过鉴定，发现高抗品种2个，中抗品种7个，揭示深水稻品种或许蕴藏着其它稻类缺乏的抗病基因(陆岗等2004)；付冬等(2012)利用一个深水稻品种RSB03，与沪旱lB杂交，构建了一个包含286个个体的F2群体，定位N4个和水稻纹枯病抗性相关的QTL位点，构建了超表达载体的转基因植株，平均病级低于对照。1．4．3野生稻抗纹枯病基因资源的挖掘普通野生稻是栽培稻的近缘祖先，蕴含着丰富的遗传资源，对水稻改良具有重要意义。栽培稻是由普通野生稻经过长年的进化演变而来的，在进化过程中，普通野生稻的许多优良基因被丢失，其中包括了大量的高效营养基因、抗旱基因、耐冷基因、抗病抗逆基因和高产优质基因，且大多数性状由显性基因控制，目前认为普通野生稻中含有更多的优异基因，保持了高水平的多样性和完整性。在印度野生稻、巴蒂野生稻、药用野生稻中均发现水稻纹枯病的中抗品种(Prasad和Eizenga2008)；广州农科院鉴定了493份普通野生稻的抗病性，筛选到一批对稻瘟病、白叶枯病、纹枯病和细菌性条斑病单抗或者多抗的品种，包括4份中抗纹枯病的材料(韩飞等2007)。目前已在野生稻资源中发现了抗褐飞虱基因，通过杂交获得了一大批抗性创新种质。发掘利用野生稻中的纹枯病抗性基因，或许是一个很好的获取优异抗病材料的方法。4 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制1．5水稻抗纹枯病的遗传研究1．5．1水稻纹枯病抗性基因的定位目前已报道的抗纹枯病基因超过100个，其中50多个抗纹枯病QTL存在明确的置信区间，在水稻的12条染色体上均有分布，其中第2、3、5、7、8、9和1l染色体上定位到的QTL数目较多，部分区段上检测到的QTL具有较高的重演性，至于它们是同一抗病基因还是基因簇在起作用，尚需进一步的研究(左示敏等，2010)。定位到的QTL大多是由数量性状基因控制，不同程度地增加纹枯病抗性但均未达到完全免疫水平，易受环境影响(Lietal，1995；潘学彪等，1999；Zuoetal，2000；Hartetal，2002；Pinsonetal，2005；Sharmaetal，2009)。黎志康利用感病品种Lemont和抗病品种Teqing杂交，对后代F4混合群体进行分析，定位到6个QTLs，效应最大的一个QTLQsbr3a，位于第3染色体标记RG348一RG944之间(Li等1995)；潘学彪对抗病品种Jasmine85和感病品种Lemont杂交组合构建的128个F2世代的单株无性系群体进行分析，发现了6个QTLs，能解释表型变异的14．4％-22．2％(Pan等1999)；韩月澎以珍汕97和明恢63为亲本构建自交系群体，对Fll、F12进行分析，检测到的抗病QTL位于第5、9染色体上，来自明恢63的等位基因增加抗性水平，同时发现一个与植株松紧度相关的主效QTL，位于第9染色体的抗纹枯病QTL区间附近(韩月澎等2002)；国广泰史以窄叶青8号和京系17为亲本，Fl世代的加倍单倍体群体定位到四个QTLs，在水稻的第2、3、7和11染色体上，qSBR一2、qSBR．3和qSBR．7的抗性基因由抗病亲本窄叶青8号贡献，qSBR．11的抗性基因由感病亲本京系17贡献(国广泰史等2002)；CheN用由4011和湘早籼19杂交的F2群体进行分析，4011是一个携带纹枯病抗性基因的转基因水稻，湘早籼19是一个高感纹枯病品种，在第5染色体标记RMl64．RM39区域检测到一个抗纹枯病主效基因Rsbl(Che等2003)；Sato利用以为轮回亲本，WSS2为供体亲本构建导入系群体，在第3、12染色体上检NN2个QTL，抗性等位基因均来自抗病亲本WSS2，共解释29．6％的表型变异(Sato等2004)；l'insonN用Lemont和特青的杂交后代进行纹枯病抗性分析，验证了前人的定位结果，同时发掘了15个新的QTL位点，其中6个抗病QTL的确切位置和效应值得到证实(Pinson等2005)；谭彩霞利用Lemont和特青杂交的115个F2单株无性系群体进行分析，检测到两个QTL-qSB-9和qSB-11，其中qSB-9的抗性等位基因来自于抗病亲本7eqing，qSB一11抗性等位基因由感病亲本Lemont提供(谭彩霞等2005)；谢学文利用Lemont和特青的双向导入系群体进行抗病QTL分析，两种背气 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文景下检测到的抗病主效QTL个位分别为6个$n9个，重复检测到的QTL有2个，说明QTL表达具有明显的背景效应，指出通过聚合不同群体中定位到的QTL可以有效提高水稻的纹枯病抗性(谢学文等2008)；高晓清对导入系群体进行纹枯病接种和人为筛选，获得了株高、产量和轮回亲本相似，抗病性显著提高的改良后代，说明对导入系的定向改良可以用于育种生产，对BC2F2群体进行QTL定位，检测到12个和纹枯病相关的主效QTL；左示敏利用qSB．11胞区间的112个染色体片段替代系，将qSB一11把范围缩小至78．871kb的区间内，位于分子标记Z22．27C和Z23．33C之间，这一区间的日本晴序列包含11个开放阅读框(ORF)，预测可能存在候选基因(Zuo等2013)。1．5．2全基因组测序法寻找候选基因对研究常用的纹枯病抗病、感病品种基因组的测序将大大促进抗病机理的研究，基因组序列信息将为从分子水平上揭示SNP差异、插入缺失序列等。通过对13个自交系栽培品种、3个纹枯病抗病品种(Jasmine85、MCR010277、TeQing)、3个纹枯病感病品种(Cocodrie、Cypress、Lemont)以及11个纹枯病中抗品种进行测序，一共发现333个ns．SNPs存在于抗病品系中，而在感病品系中相应的缺失，和抗病相关的选择变异大多位于11、12染色体上。含有选择差异ns．SNPs的200多个基因归于42个基因家族，几个候选基因家族在先前的研究中报道过，同时检测到3个新的候选基因家族(JamesSilvaetal2012)。在第9染色体的底部，位于标记RM215和RM245之间约1．2Mbd的区间内，曾定位到一个纹枯病抗病候选基因qShB9．2，测序比对结果发现，在qShB9-2区间内，大多数变异为S．SNPs，占比例的73％，较少数变异为nS．SNPs，占比例的26％，最少比例为插入和缺失突变，占比例的l％。通过对155份变异材料在此区间的CV选择分析发现检测到的ns．SNPs总共存在于10个基因中，属于7个基因家族(JamesSilvaetal2012)。发现了3个新的纹枯病抗性候选基因区域，分别为第2染色体顶部，第3染色体底部和第5染色体底部。通过对ns．SNPs以及染色体上基因的相关性分析，发现存在于第2染色体上的差异最多，有70个ns．SNPs和49个候选基因，第5染色体上检NN7个as．SNPs和7个候选基因，第7染色体上检NN9个ns．SNPs和2个候选基因(JamesSilvaetal20】2)。6 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制1．6本研究的目的和意义纹枯病是目前我国水稻栽培区发病面积最广的水稻病害，严重制约着水稻产量的提高和稻米品质的改良。纹枯病的抗性遗传研究一要寻找具有较高水平的抗源，为生产应用提供资源；二要把抗病基因结合分子标记辅助选择等手段导入到当前推广的品种中去，定向改良水稻品种。本课题采用两套材料作为纹枯病抗性鉴定分析群体，一套材料为高代回交并自交多代的C418导入系群体，对其基因型进行分析，各株系遗传背景和C418极为相似，只是个别染色体区段来源于供体亲本。在相对纯化的遗传背景下，寻找优良等位基因，探讨基于遗传连锁作图法定位QTL的可行性和水稻纹枯病抗性基因定位结果的准确性。另一套材料包括抗旱核心种质、水稻微核心种质和纹枯病抗感差异材料共344份，对其进行纹枯病接种鉴定和抗性评价。试图挖掘水稻种质资源中的有利等位基因，为水稻的分子育种提供基础。7’ 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2利用导入系分析水稻纹枯病抗性位点和效应2．1材料和方法2．1．1实验材料以目前生产中广泛应用的粳稻恢复系C418为轮回亲本，BR24、Cisanggarung、Dhan4、滇屯502为供体亲本，选育获得269个BC2F4导入系。导入系群体2011年上海为BC2F4，2011年海南为BC2F5，2012年上海为BC2F6。C418来自辽宁农科院稻作研究所，BR24为来自孟加拉国的高杆抗病品种，Cisanggarung和Dhan4分别来自印度尼西亚和印度，滇屯502来自云南个旧市种子管理站，以上材料均为本实验室保存材料。实验所用纹枯病菌有两种，菌株沪HGWK由上海市农业科学院生态环境保护研究所张穗研究员提供；菌株RH．2由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。2．1．2实验方法2．1．2．1田间实验设计本研究对导入系亲本及群体材料共进行了三次田间接种鉴定实验。分别于2011年6．10月在上海白鹤实验基地(E1)，2011年12月．2012年5月在海南陵水基地(E2)和2012年6．10月在上海白鹤实验基地(E3)。秧田播种，约25天移栽秧苗，每个株系种植3行，每行7株，株行距为15cm×20cm，田块四周种植保护行。按照常规的田间管理方法进行灌溉、施肥、打药，在水稻生育期内不使用杀菌剂防治病t立，口o2．1．2．2水稻纹枯病菌接种接种前的准备工作包括：PDA培养皿的制备、菌丝活化、牙签灭菌。首先将实验室低温保存的菌种取一小块，放置在新鲜的PDA培养基上，待菌丝活化并生长蔓延；将牙签剪成1cm长的小段，灭菌，均匀铺洒在PDA培养皿上，在培养皿中央放置一块带菌培养基，恒温恒湿培养箱(温度28。C、湿度40％)避光培养3-5天，当菌丝覆盖所有牙签并蔓延至培养皿边缘时即可进行田间接种，此时病级的活力最强。R 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制田间接种时期约为水稻秧苗移栽后30天，此时水稻生长处于分蘖末期时，选取每个株系第2行的中间3株做为接种材料，用镊子将带菌牙签轻轻插入倒3叶的水稻叶鞘内，尽量保证植株原有的抱茎状态不变。2．1．2．3抗病相关性状考察考察田间性状并记录抽穗期，水稻抽穗后30天待病情稳定时进行调查，鉴定指标包括株高、分蘖、病斑高度、病级。测量接种单株中发病最为严重的一个分蘖，以3个接种单株发病的平均值代表该株系的抗病水平。具体方法为：株高(plantheight)：植株最高稻穗顶花颖尖到土表的距离(cm)；病斑高(1esionheight)：茎杆最高病斑的上界至土表的距离(cm)；相对病斑高(relativelesionheight)：病斑高占株高的百分比(％)；病级(diseaserate)：植株发病的严重程度，按0-9级标准；抽穗期(headingdate)：该材料50％植株始穗期的天数(天)；结实率(spikeletfertilitypercentage)：单株总实粒数占单株总颖花数的比例(％)；千粒重(1000一grainweight)：1000粒种子的重量(g)。2．1．2．4病情评价标准病级(DR)采用Rush先生制定并经扬州大学农学院研究组修改的0-9级标准(左示敏等，2006)。0级：植株健康无病；1级：病斑在倒6叶鞘上或更低；2级：病斑扩展至倒5叶鞘上；3级：病斑扩展至倒4叶鞘上；4级：病斑扩展至倒3叶鞘长度的一半以上；5级：病斑扩展至倒2叶鞘长度的一半以上；6级：病斑扩展至倒1叶鞘长度的1／4至1／2范围内；7级：病斑扩展至倒1叶鞘长度的1／2以上：8级：病斑扩展至剑叶长度的1／2以上或死亡；9级：植株或植株中的多数茎秆因纹枯病而非正常死亡。9 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2．1．3表型数据分析实验中纹枯病抗性相关的各性状表型数据的统计描述，不同环境下性状的方差分析，性状间的相关性分析等主要采用Excel2007、SAS和SPSSStatisticsV17．0统计软件进行。2．1．4基因型分析2．1．4．1DNA提取对移栽后约20天的亲本及导入系群体取样，每个材料选取幼嫩的叶片约5cm。采用改良的CTAB法，将提取的DNA溶于ddH20，于紫外分光光度计中检测初浓度，稀释并制备DNA工作液，终浓度为25ng／uL左右，于4"C冰箱保存。2．1．4．2亲本多态性筛选作图所用分子标记为SSR标记，根据Temnykh等(2001)发表的引物序列，上海生工生物工程公司合成，为实验室公用引物。首先对两亲本进行引物多态性筛选，具有多态性的引物用于群体分子标记。实验操作流程为：用所有引物对亲本DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在5％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)A2泳分离，电泳产物用简易银染法检测分离状况，将双亲间显示多态性的引物挑选出用于群体分子标记。群体基因型鉴定采用3％的琼脂糖凝胶电泳，产物用溴化乙锭(EB)染色，然后用紫外拍照系统检测产物分离状况。SSR是共显性标记，统计基因型时，将带型与轮回亲本C418一致的记录为1，与供体亲本一致的记录为2，杂合带型记为3，缺失及异常带型记录为0。PCR反应体系、PAGE电泳、琼脂糖凝胶电泳及简易银染法见附录。2．1．4．4遗传连锁图谱的构建和QTL分析用GGT软件构建分子标记遗传连锁图。采用分析软件QTLIciMappingV3．0对导入系群体E1，E2和E3三个环境中所测定的各性状进行的QTL定位分析，采用逐步回归分析方法以P<0．005，LOD>2．0作为判别QTL存在的阈值。该软件同时会给出基因的加性效应，基因对性状表型变异方差的贡献率，包括主效QTLs和上位性QTLs。QTL的命名采用McCouch等(1997)的方法。10 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制2．2结果和分析2．2．1表型分析2．2．1．1亲本和群体的表型经多年接种鉴定，C418为感病品种，BR24、Cisanggurang、Dhan4、滇屯502均为中感品种。轮回亲本C418各性状在三个环境中表现较为稳定，变幅较小。BR24在上海和海南环境下差异明显，该品种在上海为典型的高杆，株高171cm，病斑高68cm，相对病斑高39％，病级5级，在海南株高132cm，病斑高70cm，相对病斑高53％，病级6级，两地病斑高度接近，在上海由于株高增加而降低了一个病级。滇屯502在上海和海南环境下也有差异，该品种在上海为晚熟，抽穗期120天，相对病斑高42％，病级5级，在海南抽穗期89天，相对病斑高58％，病级6级，两地病斑高度接近，由于受感光性的影响，在上海抽穗期的推迟而表现出抗病性的增强。对C418导入系及亲本的田间性状观察发现，导入系群体的株高、株型、生育期和产量都和C418相似。上海环境下C418株高109．67cm，病斑高59．89cm，株型紧凑，抽穗期86天，千粒重27．719；导入系株高平均值115．74cm，95％置信区间114．28cm～116．73cm，病斑高平均值58．07cm，95％置信区间56．70cm一59．42cm，千粒重平均值24．319，95％置信区间23．909～24．719。和C418亲本相比，导入系的株高平均增加6cm，病斑高度降低约2cm，千粒重降低。从上海的表型看，导入系群体抗病性比C418略有提高。海南环境下C418株高102cm，病斑高57cm，抽穗期80天，千粒重28．959；导入系株高平均值103．66cm，95％置信区间101．97cm～104．74cm，病斑高平均值43．34cm，95％置信区间42．07cm-44．58cm，千粒重平均值24．519，95％置信区间23．659~25．639。和C418亲本相比，导入系的株高不变，病斑高度降低约14cm，千粒重降低。群体的抗病性表现较轮回亲本有很大提高。对四个供体亲本的导入系群体比较发现，BR24、Cisanggurang导入系群体的病斑高、相对病斑高和病级均偏高；Dhan4和滇屯502导入系群体的病斑高、相对病斑高、病级较轻微。 NHh_【o}州po∞已∞o．I一o．o口c惜一_【∞-I∞。岛'【_}o一_【o≯∞_【．水罂郴吲叫^蕈癸v}簧∞o。op时co州。时_【∞．I．Iou∞oc呻u州¨叫c∞州∞**．*碍_【o．o嬖^蕈癸v}簧∞o．o博惜僻礤求羹．*∞岔N．Ino．I寸o．I∞c．一卜岔．0∞岔-oN_【．INH．I岔o．I卜H．In昏．0@o．I西乙．心Do．9∞寸．9卜n．9on．9△一．9N岔．9n∞．9∞△．9n∞．9_∞．9卜∞．9装心c．N一摹毯．o一装心寸．0H摹oA．oH装寸c．oH摹∞n．o'【摹_o．IH摹仓∞式．【装婚'【．IH装n9．HH摹卜c．o一装”tH一摹卜寸．卜寸**摹一一．6n心小心n．卜寸|c装no．0”，Ic*装卜寸．o寸*摹”tn寸摹II试n**婶兮on．n寸摹饕式n摹卜Q试n羹摹n∞．9寸摹∞o．葛o∞．N一岔n．0一N卜．oH岔N。N'【nn．=n心6一岔o．I—n乜N_【寸卜．0Ho心．一'【∞∞．8寸n．0H蛤∞．￡n聱*N寸．o寸卜c．呐n*∞￡．∞价**岔∞．0寸董n吗．一蚧n■H岭羹jI谚。寸寸NH．I岭。母寻嶝*鼍小心一寸H心式峪nN．n一卜_【．N_【心峙．IH岔H．o—N吒小∞H．6on．8oo．8仓”．6N●∞H心H．9HN乜卜'【10“一一*鲁n冀寸oHnn．8H—oN．c_【H**卜∞．00_∞■cI_【卜tNH一*蕾nn．No'【n仓．9'【H卜N—H'【*=∞．co一”￡．∞．【_【n∞N叫H岫n叫N叫一∞n闯N∞H∞n∞N衄H∞n卜∞1I式on曾然Hn∞JH。葛rBoQ寸卜岔峪们厂T叫．潍—_州'Jfl比M—H时们一_、∞厂IH。寸N醋∞Q∽c母D掣zgQ搽爆Q∞磊Q乏Q∞写。芝}{d笛恒蜜惧靛娶^go。}{厂I恒蜜婆0∽_rBDq、I^暑。v}{山甚。IIIuoJIAIIQ∞oIIIlJo．oZIIo焉一=厶。厶恒粪辉薛释长鞲挺枯∞_IIo—IJ岛o．I一>口o=l口o．I曲匠一勺．Io勺cj∞oaII口。一∞∞o-IMo．I_II一．Io口。勺．I；oJ铀o∞oQ占ocQI；I厶心。一D．I茁尽髅星田g卜螺薛匿k赳葵赳，酶删垛<蹄葚毯牛臣N悄cc．9装。寸岔”∞n．cn胬．6∞盘puH谜岳菪9高cIg口oQ将磔母举毽专S鼍I{Qcc．9摹△岔．葛A∞．InS“岔嚷olIopuH茸陋政越岳葚oJBdJ星oQ酱帐跫举毽逞饔∞蠹鲁暑嚣磊∞6cc“摹no．荨oos∞S寻2号QpB一∞趸∞皿裂最情菪等dJoIIoQ将帐葚举≈专点寸Ng∞nc．卜装心o．9”岔∞．6n△∞．∞oH霉互u皿蚤菪警三口譬Inoo配祷帐凰辩≈怠SA≮∞H寸u^磊。芝-匣Q^磊。芝_)Z蛊^磊Q苫．)}{厂I^磊。至-王山释馔挺臻崾霞娶^III。v恒蜜爆(muv恒卷II侵!Jo爆米苗SII—o∞f1嫂旺∞Q130Q∞DTl∞妻茸oII习Z婶熏呕Qo磊釜∞aJ暑甚I—oII苜。专【IIsQu磊一JB>JIo舞勺磊∞QIIII—gII警QD暑-o∞II砬!Jo-【Q—D月卜酲擗趔露逍寤惧撂《《聪米将怅S帐<蹄_僻仪秘迥扑划妖窿．千匿哩n10N孙K爿《世斟 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制BR24donorintrogressionlines25％30％35％40％45％50％65％60％65％70％75％RLHCisanggarungdonorintrogressionlines25％30％35％40％45％50％55％60％65％70％75％RLHDhan4donorintergressionlines25％30％35％40％45％50％55％60％65％70％75％RLH滇啦02donorintergressionlines25％30％35％40％45％50％55％60％65％70％75％RLH图1亲本及导入系群体的相对病斑高在三个环icdistributionofrelativelesion专MMeeaannvvaalluueeo。ffcB4R1284i，■■E1口E2■■E3MeanvalueofCisanggurangMeanvalueofC418‘亡l口E2_E3[]一MearlvalueofDban4MeanvalueofC418E1E2E3Meanvalueof滇屯502MearlvalueofC418E1E2E3境下的分布heightintheintrogressionlinesacrossthree13m"∞C=-O皇m"lJI一-口皇上；‘∞￡=-O皇上；工口．∞lJI一|．O生 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2．2．1．2三个环境下导入系群体中各性状的方差分析由于上海和海南环境气候的差异，材料的农艺性状和抗病水平也会受到一些影响。对导入系群体纹枯病的抗性相关性状进行单因素可重复方差分析，结果表明E1、E2、E3环境下，株高、病斑高、相对病斑高的变异均达到极显著水平，环境间差异也达到极显著水平。对同一性状在不同环境下进行了Fisher最小显著差检验，分析各组均值间的差异水平，当组间均值差大于LSD时，认为两处理的均值差异显著。多重比较的结果：株高的变异最大，E1、E2、E3间的差异均显著；病斑高在El和E3间无差异，E1、E3和E2间差异显著；相对病斑高在E1和E3间无差异，E1、E3和E2间差异显著；病级在E1、E2、E3间均无差异。表3四个性状在不同环境的方差分析。Table3ANO、／Aof4diseaserelatedtraitsindifferentenvironments．1’raitsSumofDfMeanF-valueFcritP-valuePr>FSquaresSquare=3．007PH(cm)3100421550298．83>3E-39<。000l车幸LH(cm)43329221665155．00>7E-58<．0001宰奉刚m(％、146。62％273．31％52．80>3E-22<。0001}卑DR3．55521．7771．35<0．258N*P=-0．05，料P=0．01表4各性状间在不同环境间的最小显著性检验。!垫!皇垒兰呈箜!!i罂i鱼里垫堡垒i垡!堡垒里!!曼!!i垒g!里坐!塑堡垒i!呈箜!堡!坐垒型堡垫垒i壁!翌坐呈型i翌翌巴呈旦tS．TraitEnvironmentNumberMeanvalueIxi-xjLSDSig．0．0514 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制2．2．1．3抗性指标之间的相关性分析相关分析结果表明：三个环境下，株高和相对病斑高均呈现出极显著负相关，株高和病级呈现出极显著正相关，病斑高和相对病斑高成极显著正相关，病斑高和病级成极显著正相关，相对病斑高和病级成极显著正相关。结实率、穗粒重和千粒重在E2、E3也表现出相关性，相关性程度不高且不稳定，表明产量性状容易受到环境条件的影响。产量性状和抗病性状间的相关性多为负相关且相关系数不大，E2环境下病斑高、相对病斑高、病级和穗粒重间达到极显著差异，表明纹枯病的发生会对水稻的抽穗、灌浆造成影响，穗粒重降低，即单株产量减产。表5导入系群体在E1(上)、E2(中)和E3(下)三个环境下的性状间的两两相关系数Table5CoefficientsofpairwisecorrelationamongthetraitsfromintrogressionlinesobservedinE1【业巳曼堕：垦!里i皇生!虫塑鱼旦(!旦!盟株高病斑高相对病斑高病级结实率穗粒重千粒重株高病斑高相对病斑高病级结实率穗粒重千粒重1．0000．5lO0．124．0．109．0．404**．O．313木·．0．526**0．378**0．221幸事0．409**．0．021．0．0310．0790．0760．0440．0451．0000．886**0．895**0．862**0．768**0．758**0．807**．0．1060．080．0．297**．0．043．0．042．0．0541．0000．877**0．820**0．848**．0．0940．094．0．263**0．024．0．080．0．0231．000—0．0990．0941．000．0．208**0．326**1．0000．0600．573**1．000-0．058．0．0320．472**1．0000．0080．1380．447**1．000a对角线上的数字分别表示同一性状在E1和E2(上)。El和E3(中)，E2和E3(下)环境间的相关系数。b+，t,O分别表示在0．05水平(双侧)和O．01水平(双侧)上显著相关。aThediagonalindicatestraitcorrelationcoefficientbetweenE1andE2(uppeO，ElandE3(middle)，E2andE3(10wer),respectivelyb+‘，‘‘SignificancecorrelationatO．05level(bilateral)and0，Ollevel(bilateral)，respectively． 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2．2．2基因型分析通过对实验室的两千多对SSR引物进行亲本多态性筛选，共筛选出150对引物在亲本间呈现出不同程度的多态性，且扩增条带清晰。Gramene网站上查找引物的基本信息，用GGT软件绘制遗传连锁图谱，该图谱覆盖了水稻12条染色体，总图距2348．64cM，标记间的平均距离为15．65cM，平均每条染色体上14个标记，第11染色上标记数目较少，存在Gap区域。本实验中提取DNA用来做基因型分析的导入系群体多数为BC2F4代，还有一些为BC3F4代，基因型片段导入的理论频率为0．062～0．125，实际导入频率均在预测范围内。表6导入系群体中亲本基因型频率和供体基因型频率的组成情况．．Table6Thestatusoftheparentalgenotypesanddonorallelicfrequenciesintheintrogressionlines．．．．．．．．．．．．——群体轮回亲本供体亲本杂合供体基因导入理论值PopulationRec叩mDonorHetero药gote1婴gressedallele唧oreticalparent。。OtQOnorvalue表7四套导入系群体中代换片段的背景回复率!垒!!皇垒!鲢堡P!堑呈坐皇垡垡呈里!塑!．o坐!i旦g!皇!皇鲤里坐里垒!堑堂!Q坠!!里箜础，+基因组总图距代换片段总图距覆盖率矸。降cM％D，、。1。“，、．GeneticdistanceoftheThelengthofsegmentCoveragerate上JOPulatlOnhoWla01legenomeSUlDSt’1’R‘lt‘l‘On从表7可以看出，四套导入系群体中导入片段的平均背景回复率都比较高，BR24．ILs为94．5％，Cisanggurang-ILs为95．7％，Dhan4-ILs为95．7％，滇屯502-ILs为89．1％。其中四套导入系所共有的背景回复区域为2209．5cM，占水稻基因组总遗传图距(2348．6cM)的85．6％，充分保证C418背景的导入系群体中大部分区域均有置换片段，导入系的遗传背景基本与轮回亲本接近。16 ．HN寸H寸HHnHnH∞．HHH=卜一譬u舯薯。咖口一曲。兰oII一暑—李∞；Ugp蠕∞Q奄一io暑。瓮olp二一兰。拦。譬强口口辱．，o嚣三∞}Q^I甚M∞Z对。匠世凝释翟日醐牮静譬∞一6憔僻培斌．键较掣罴do寸NH。H∞on崎“∞H．6卜■ooc．卜N厶．∞_寸∞．o．∞o．o．卜o-0。∞o．o．仓H．8。NN．卜．oo．0I-n，o．NH．0。心o．0．NnoH．卜心．厶Ao．8o心一No式H寸厶．nn岔冀寸H岔众．I寸nc．∞H心冀oN卜N．nN∞o“H卜tn．【N寸nH心一．cH_【乜寸Hnn．n—n寸口_ns．n_o吼．1Hno．0Non．0N＆．8N∞．cHo冀n—no．cn冀卜寸S．N心∞．8寸N式nn．Nn昏．乙N心式∞C．N_【n“卜心式H吨N卜心式∞∞式nn式H寸式寸n．cn冀noI．Nn∞式价卜．NNnn茎盈onN卜茎盈卜△NH羔配onN卜茎配N心¨芝配oo寸蔓配∞卜N∞茎配寸HA口吾H寸16∞芝配nN价茎配o_n呐暑配寸HA心芝配nN呐羔配o_nn蔓盈o【￡n茎配卜on蔓配oI￡”羔配卜on艺配H∞∞cI吾HoHnn苫配∞N岔一H苫配n衄n田N∞N叫n∞n嘲n∞一岫n衄n∞H∞n田n∞n衄n叫n∞n叫寸弓l_H厶口n勺Z厶口N口}{山守_【它}1厶叮石gQ巷Nu}{厶口_u}{乱叮_D岳Q叮nD}{■国口ND}{—岳叮一D}{为IbnD王厂I可ND}{厂I口HD}{一口≮配Q口q}{—g叮一时}{—鬣叮H日}{，I口岛}{乱叮锚}{厶叮焉}{山口俺卷《倏俺蜷聚倏建塞诞靛罂幄蜜倏翳螓桓蜜慑茛罢恒寒倏∞1I文on曾璐∞■H．葛≈IlQ∞j_岛蓥器_≈∞_J妪蜷∞1I§N匠∞口q《^摹-a八厶避狡趟，廿R料疆暇刮琳矗)lJB_五Qo一粤蠖Qgo∞旨2aJ_口Q謇o．I．1>lI叠基。襟骡薛一b∥=时-卜IIo一葛一jQo山葵掣堆枯∞一卜d狡州烈堰惧摆《g雨嚣辖垛<蹄髀臣∞僻器窭降求g爆警《堰靶*$琏帐<蹄旺熏 寸寸∞N寸寸ln岣。岔岔2nN卜2卜gN卜2H寸寸HH_一HHnHNc-qNt'qHt"q∞．【∞to．o岔．o．婚H．0．∞o．o．∞o．0．n℃．8．no．0I-∞H．o．卜o．o。∞o．0．竹o．c．卜■寸n心．o卜o．0。Ho．0．No．0．寸o．0．no．0。No．o．N_【．o．nn．0．nn．0。NN．1．nn．￡H．寸N．011．0．寸∞．0．no．0'【o．0．西N寻岔H．o．心∞16。N寸．0。寸o．0．一n．8。岔H．c．心_【．0。no．0．卜o．0。∞o．0．卜o．0。no．0．寸o．o。no．0。卜o．0．No．c_【．o卜N_【．oN．0．cI“n卜．寸心口．寸价卜．寸No．寸一n．nno．nNt寸寸H．寸Non“NnH．cNH6．仓NNooN∞D．cN吼卜．nN寸∞一NH价“心∞n．9N∞n．cNoH寸N岔∞式no峪oN卜o．寸Nn6．岔N∞HoNcI“n卜．寸口心寻价卜．寸No寻Hn“no“N卜．寸n寸．寸∞寸．寸NN寸'【卜“N●寸寸。寻卜。寻岔∞．寸H寸寸∞”．寸no寸n一．寸卜岔墉寸∞．寸N一寸Nn“寸一寸岔Hn蔓配o∞'【苫甾H寸n芝幺QH”l^盈o∞H乏g△Hn芝酲o∞H岁盈H寸nl^乏寸'【岔∞苫醋寸H岔心苫配。卜仓nS_g寸_吼心乏甾noN岔H蔓配oono羔幺卜nN乏甾岔卜心nN乏匣岭n∞心I^H甾口卜N茎配noN吼H孓_篮nH_【_【羔配卜on吾HH∞∞nH毫酲心n∞o岁_笛n_1【_【芝配卜onS乏H寸n茎酲H寸n苫《N∞n吾HH寸n苫酲H寸n；HH寸n吾HH寸n羔醚N∞n艺gnN价茎配n—n艺名nNn茎盈nNn芝酲oHn”茎囤oHnn芝配oHnn茎盈oHnn芝酲oHn¨蔓盈oHn”芝醴oHnn茎goHnn茎醒oHnn茎配oHn”芝酲卜onS叫笛卜on蔓盈oHn”茎盈n衄n∞n岫n曲n叫n∞n曲n衄n田n∞n幽n∞n叫n∞n田n∞n衄n∞n固n∞《爆恒寒馔靛翼恒蜜倏∞1I毒写IlQ暴螓恒蜜倏靛罂恒碳惧螺懊恒磷烬茛罢∞一H．∞垂T1∞∞磊∞6N吼．N'【．价卜．o．N价．价N-【寸．寸卜onH壶寸H∞∞心_壶Hn∞恒臻惧∞广IH。寸Ng∞N勺勺《一勺勺《^摹v∞>山垡Q芒时夏NQH．JquH矗)I奄窆HQH．J工u芑。暑aojI≯c∞=时JJLao焉一fldo厶N毯较掣景H通较盟量姆疆暇副僻QoJN腰冀N葚姻臻．【粤蠖_葚函球挥薛葵掣簿嚣∞oIIIIIJo一∞∞2∞2菪IJTl0J暑ulsj兰暑I—oII葛oqSo_ooIlg∞Is2．IoJ鼍芑。苗它∞JI母cI∞厂I■oo一葛荟Q∞△Q一卓芦∞一一a世州S两器辑帐<蹄榔臣文锵仪秘翠扑划妖畜_千器哩cIoN扑K爿《哥斟 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制瑚i111124lCisanlgutanlOh=f'●l们”“棚2瑚■∞K睁ljq2●345图2四个导入系定位到的水稻纹枯病抗性相关QTLsFigure2QTLsaffectingsheathblightdiseasedetectedinfourintrogressionlines191'O．IdTf55eo——#鼍麟嚣：莲瓮黧；：=：=_=：《R‘女e∞7t5．5，7|辇一7a5lR％M∞5一lⅫ瞄∞轴1委￡％"豁馘，、、壤璐∞o撼‘／罐黑眷簿臻l一"¨16黧～一鬻薰豢逖一 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文∞1∞IPillL矗IRLNID-7㈣∞20嘲3。列5掰轻赫{S黛11鞠{6俺3，3嚣彰繇￡3钉'oa一嘿蓑雕56酊25^稳l囊麓13铝56l一§l麟姗漱q嚣l“擞乩‘§i萋≈射7∞310t．0⋯§钢竹3斜，13o、童徽”11洛g．0-遵黼{7ll{'22m”■霪篓黧怒罐舞嬲铷31彀e—墨躲豁Bg'妊I一≤4’●5图3导入系定位到的水稻纹枯病抗性相关QTLsFigure3QTLsaffectingsheathblightdiseasedetectedintheintrogressionlines20晰R1“3瑚32鬈邋麓嚣嚣j袋f琳5簖，o●7攀娜”7住p7iRM2172'3．8一秀囊l一3骚1鍪l一飘l¨一习触，1拈釉g、、莲附130et‘，／：羹R舢。IT“Ig'1277s0,56冀1"1．雕枷1'tOmB一凑ll|Il6篱；；；；；冀彰；翻薏_；；纛硼■滔臻冀爹冀蹲A弼转拈博孔嚣玎昭特盯&H辩拼甜舄～黼～黼=溯渊黼黧趱一蛳n00隅．．．m．．．m00㈣．●．憾 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制2．2．3定位到的水稻纹枯病抗性0TL2．2．3．1主效QTL共检测到21个主效QTLs，单个QTL的贡献率为8．71％,-41．99％(表8)。其中控制株高的主效QTLs有9个，效应最大的1个QTL位于第11染色体上，来自C418的等位基因增加株高，剩余8个QTLs的等位基因均来自供体亲本。检测到控制病斑高的主效QTLs有4个，加性效应分别为．14．32、．10．00、．7．22和．8．19，均为来自C418的等位基因增加病斑高度，即供体亲本的等位基因降低病斑高度，增加抗病性。检测到控制相对病斑高的主效QTLs有5个，表型贡献率分别为20．03％、11．90％、13．16％、13．42％和13．77％，同样均为来自供体亲本的等位基因降低相对病斑高，增加抗病性。检测到控制病级的主效QTLs有3个，其中BR24-ILs和Cisanggurang-ILs的抗性等位基因来自BR24和Cisanggurang，分别位于第1染色体的标记RM5310和第3染色体的标记RM6914，Dhan4．ILs的抗性等位基因来自C418，位于第l染色体的标记RM562。2．2．3．1互作QTLs共检测到26对互作QTLs，其中单个上位性QTL能够解释表型变异的4．02％32．89％(表9)。其中影响病斑高、相对病斑高和病级的上位性互作QTLs分别为9对、12对和5对，增加抗病性的有利等位基因多数来自于供体亲本，除了Dhan4．ILs位于第2染色体上标记RM341的一个抗病基因，该位点的C418等位基因增加纹枯病的抗病性。互作QTLs分布于水稻的9条染色体上，除了第8、第10和第11染色体外均有分布，互作QTLs包括主效QTLs和主效QTLs之间的互作，也包括主效QTLs和非主效QTLs之间的互作。比如Cisanggurang-ILs控制病斑高的一对互作QTLs，为主效QTLs和主效QTLs之间的互作，解释表型贡献率的29．91％，加性效应为．3．19和一4．57，超过了两个主效QTLs效应之和。又如BR24．ILs控制病斑高的一对互作QTLs，为主效QTLs和非主效QTLs之间的互作，解释表型贡献率的29．93％，加性效应为．12．70和．1．22，相比主效QTLs的加性效应要大一些，非主效QTLs的加性效应会小一些。21 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2．39论2．3．10418导入系的分析导入系又称染色体片段代换系(IntrogressionLines，ILs)，通过对杂交后代进行多次回交，使供体亲本的片段导入到轮回亲本中，导入系的背景回复率高、群体结构稳定、QTL定位精度高、遗传效应分析准确，极大限度排除了遗传背景与基因间的干扰，是对QTL进行精细定位与克隆的良好材料。本研究发现，四套导入系群体共定位到的25个QTLs中，只有1个QTL在BR24．ILs和Cisanggurang．ILs中同时被检测到，其余QTLs都只在一套导入系中被检测到(图2)。表明四个供体亲本BR24、Cisanggurang、Dhan4和滇屯502含有不同的纹枯病抗性基因。2．3．2水稻纹枯病抗性OTLs分布及其利用共检测到控制株高的QTLs有8个，控制病斑高、相对病斑高和病级的QTLs有19个，其中2个QTLs同时控制株高和发病，其余株高相关QTLs和抗病相关QTLs相互独立，也就是株高对纹枯病的发病水平并未造成直接影响，为以后的图位克隆和纹枯病抗性机理深入研究提供了良好的候选基因。定位到的19个纹枯病抗性相关QTLs中，有6个QTLs一因多效，同时控制着病斑高、相对病斑高和病级，分别为第l染色体上RM5310、第2染色体上RM341、第3染色体上RM523、第3染色体上RM6914、第7染色体上RMl80和第12染色体上RM519。这些QTL一致性的富集区域，可能成为C418纹枯病抗性改良的重要靶点。本实验定位到的QTL多数和前人定位结果落在染色体的同一区域或邻近区域，也发现一些新的抗病位点，分别位于第3染色体17．2Mbp区域和第12染色体19．9Mbp区域附近。李芳利用Tarom和Molaii导入到IR64和特青的四个导入系群体，将纹枯病的病级、相对病斑高定位于水稻第2、第3和第7染色体上，本实验也定位到相近区域(李芳等2009)；Liu利用Jasmine85和Lemont的重组自交系，将抗病QTL定位于水稻第1、第2染色体，本实验定位到相似结果(LiuGetal2009)；国广泰史利用籼稻窄叶青8号和粳稻京系17构建的加倍单倍体群体，定位到其中一个抗病QTL位于在水稻第7染色体，本实验也定位到相邻区域(国广泰史等2002)。22 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制2．3．3水稻纹枯病抗性得到改良的导入系株系表10导入系的抗性分析!垒!!皇!Q!里!i!!垒旦里呈!皇!曼!Q!!堕曼i望塑．旦g墨皇!!iQ塾!i旦曼!群体篙羹麦本株系数璧篙森柰鐾上病百分比P。pul翻DR0fd∞。rNo．ofnnesN。noe．。orfmlin。eresrDReducparenteperce嗍eOneOrmoreUK‘~一BR24．Ils56968。7％Cisanggurang-IlsDhan4．Ils滇屯502．Ils6745175101l2413．5％21．6％32．0％对C418导入系群体的抗病水平进行分析，寻找抗性提高的株系。轮回亲本C418的平均病级为7级，供体亲本BR24、Cisanggurang、Dhan4、滇屯502的平均病级分别为5级、6级、6级、6级。认为BR24-ILs、Cisanggurang-ILs、Dhan4．ILs、滇屯502．ILs群体材料中较供体亲本降低1个以上病级的株系为抗性改良株系。23 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文3水稻优异种质资源的纹枯病抗性鉴定与评价3．1材料和方法3．1．1材料和方法供试材料一共344份，包括经常用于纹枯病抗性研究的抗感差异材料56份，抗旱核心种质107份，水稻微核心种质181份。采用牙签接种的办法，2011年在上海(E1)和海南(E2)以及2012年在上海(E3)分别对这套材料进行了水稻纹枯病的抗性鉴定和评价。供试菌株、接种方法、田间管理、性状调查、评价指标，都和导入系的研究方法相同。3．1．2抗病性评价抗病类型分为高抗(HR)、抗病(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感病(S)和高感(HS)。其中0-1．5级为高抗(HR)；1．6～3．0级为抗病(R)；3．1～4．5级为中抗(MR)；4．6～6．0级为中感(MS)；6．1～7．5级为感病(S)；7．6～9．0级为高感(HS)。3．2结果和分析3．2．1重复鉴定的稳定性分析接种材料中有131份材料在三地的抗性水平一致，135份材料抗性水平最大差异为一个病级，56份材料最大差异为两个病级，还有22份材料抗病性不稳定，相差三个病级。三季实验均未检测到纹枯病免疫或高病的水稻品种，2011年上海检测到抗病品种20份，比例5．8％，2011年海南检测到抗病品种15份，比例4．4％，2012年上海检测到抗病品种24份，比例7．O％，其中重复检测到的抗病品种有10个，分别为：黄皮糯、赤壳糯、饿死牛、三磅七十、饭毫皮、香稻、RSB01、细麻线、南高谷、鱼眼糯。由于气候环境条件的差异，2011年上海和2012年上海的数据接近，相似度84％，均和2011年海南数据差异较大，在上海检查到的株高、病斑高、相对病斑高均高于24 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制海南，发病情况总体比海南严重。E1、E2环境下的株高平均值分别为120．12cm、120．48，E3环境下为85．07cm，约低35cm，差异显著；E1、E2环境下的病斑高平均值分别为53．33cm、58．02cm，E3环境下为35．92cm，约低17～22cm，差异显著；E1、E2环境下的相对病斑高平均值分别为46．26％、50．69％，E3环境下为43．66％，约低3％～7％，差异不显著；E1、E2、E3环境下的平均病级均为5．0级。3．2．2抗病指标和农艺性状的相关性分析从表9可以看出，病级和相对病斑高的相关系数最高，为O．88，极显著正相关；病级、相对病斑高和株高的相关系数分别为．0．57、．0．58，显著负相关，即株高增加可以减轻发病程度；抽穗期和病级的相关系数．0．16，负相关，即延长抽穗期可适当的减轻发病程度；千粒重和株高、抽穗期、结实率、穗粒重的相关系数分别为0．28、0．39、O．29、O．77，均为正相关；千粒重和分蘖、病斑高、相对病斑高、病级的相关系数分别为．0．17、．O．25、．0．48、．0．46，均为负相关，表明纹枯病的发生会造成一定数量的减产。3．2．3纹枯病抗性鉴定结果根据两年实验数据平均值的统计结果分析，株高的变化范围为70cm-160cm，平均株高106．41cm，在100cm和140cm处分别达到两个峰值的峰态分布，偏度2．15，峰度15．49；病斑高的变化范围为30cm-75cm，平均病斑高47．94cm，群体呈现偏分布，偏度O．31，峰度O．62；相对病斑高的变化范围为25％～70％，平均相对病斑高度为47．10％，群体近似正态分布，偏度O．01，峰度．0．84；病级以5级、6级的中感品种居多，未检测到1级、2级的抗病品种。群体各指标符合离散型随机变量的分布特点。将水稻纹枯病抗病类型和0---9级病级评价标准对应起来，对三个不同环境下的重复接种鉴定进行分析，共检测到纹枯病抗病品种10份，占供试品种比例的2．9％；中抗品种82份，比例23．8％；中感品种161份，比例46．8％；感病品种54份，比例15．7％；高感品种10份，比例10．8％。E1、E2、E3环境下均未发现高抗或免疫品种，抗性稳定的抗病品种的数目也很少。接种群体的中度感病品种最多，接近供试品种数目的一半。25 心N≥Q占u＆∞2‘(IBJ旦冬D一一o^。=o．o≈写^趸。堇lqv—a^o=o．o苗口。焉一芒ou8磊ouI矗Is：．。．醇。水翼摊吲q^誊癸v}长一oo冥^罩癸v}繁昌．o姑惜僻幕求：．t，I董卜●ooo．I*。@qo**心n．0。*吼n．o。|-口寸．o。**o寸ono．0寸H．0no．0．oo．1【∞_【．0-。。∞弋o．一一．0Ho．o．o．【．0．。|‘∞∞．0oo．I*n乙．o。N_．0oH．0鼍oN．o．鲁。节。量*怕n．o卜H．0。寸H．0．心o．o．蕾∞N．0卜o．0no．0oH．o．*寸代．oN一．o*|‘卜蚧．o．⑦o．o**∞n．o。峪o．0时=N'0oo．I岭o．0．oo．I悯梨巾蚓巢嚣瓣冰姆踩嚣器《惧俺臻惧靛罂恒塞馔涨求恒卷删巢巾恻巢嚣瓣椿捺踩嚣器螺螓恒蜜婆靛巽帽碾烬粼求拒娄IIo一葛In口。盆日Q恙一；ooc—Q专‰o∞o(I扫ocQ二Q龇IIo暑时∞一∞童日_≈口。一≮一。艺ou乙ID一嘎卜辖求赳永罂蛊屋葵趟，陬删跫枯熏鲻N_【秣价岔．o州oo“装婚N．9一州摹西岭．0nn岔寻_【州No．8价N奠N州N△．8oo．8-00心摹H口一∞．摹∞●@Hoo．INI-oo．oNnc．∞H-00．寸心to刊oo“摹瓮“H刊装心崎-c寸寸n．￡1【刊N西“nnN．N刊n∞．9oo．8．oo．c摹∞∞．卜卜．装n∞．o_【卜∞．∞∞．nn．o一卜心．寸H。nn．NNN．I刊oo“摹∞0n_【刊摹婚N．9寸寸∞试．【州nc．nn△卜．心州n岭．卜oo．∞-oo．N摹。卜．卜卜．摹卜岭．nHoo≮．【'【-00“N幺口《惧^装v}{习_恒蜜惧苌罂^g。v}{一幄港爆oo．6H-cn．c；粼求口卜．∞N刊∞寸．oN．【卜峪．NoN．nn．N∞Nn．oN州卜o．呐∞oo．n寸H．oo．N寸n∞．崎N刊N_【．oNHnn。n昏1【．nn．N卜^．【IID_)墨厶幄业婆Q∞刊磊。芝Q∞磊配Q∽刊磊。至o∞昌匣Q∞州磊。至oM磊幺醛蛄蠖刊姆露}迥÷瞄冥姆K略瞪磐蠖刊迥嚣}遥＼f，略罢趔K嚼醛磐蠖刊趔嚣}趔÷略罢遥K嫒n∞N衄H∞岩矗‘一爨q廿N．【oN怔建廿．【HoN避叫廿．【．【oN篓型，舔搽厘田S卜爨鸶匣k树葵赳敞恻荩枯熏蝤．【_懈似秘遥扑删硬器．千臀哩nIoN孙K爿《d|爵 EUoA1E1E2E3E1E2E3利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制E1E2篓杰蓉E3E1E2￡麓E3E1E2翻E3populationacrossthreeenvironment．X1．．株高柱形图，A2．病斑高柱形图，A3．相对病斑高柱形图，A4．各病级所占比例。B1．B3．各频率所占比例分布图．B4．各抗性材料所占比例。A1，plantheightcolumnbargraph，vertical，mearlnwit}lSEM．A2，lesionheight,lowhighbargraph,vertical，lineatmean．A3，relativelesionheight,box&whiskers，vertical．A4,diseaserate，stackedbars，vertical．B1-B3，histogram丘弼ucrIcyd枷b西ondiagram．134，percentageofdifferentresistancelevel．271O0 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文3．3讨论3．3．1水稻纹枯病抗性影响因素水稻纹枯病的发生及危害程度易受环境影响，且株高和抽穗期也是影响发病的主要因素，使得纹枯病的抗性鉴定变得复杂。环境变化有可能引起植株农业形状及抗病性水平的改变，比如本实验中所用的一个材料SadriRice，在上海表现为高杆，海南生长环境下为正常株高，2011年上海、2011年海南、2012年上海株高分别为162cm、109cm、162cm，病斑高分别为71cm、24cm、60cm，病级分别为5、3、5，海南环境下株高降低，发病更轻微，病级降低。另一个材料MIGA表现出相反的现象，2011年上海、2011年海南、2012年上海株高分别为132cm、85cm、132cm，病斑高分别为56cm、53cm、60cm，病级分别为5、7、5，海南环境下株高降低导致了病级增加。同样道理，由植物感温性、感光性造成的两个环境中抽穗期的差异，也会引起抗病性的差异。株型和分蘖也可以影响水稻的纹枯病抗性，经田间观察发现：紧凑型植株要比松散型植株发病严重；多分蘖的植株也更容易感病；叶片稠密的植株发病稍重，还可能出现叶片被病斑侵染的现象。3．3。2抗病资源筛选纹枯病的致病菌立枯丝核菌，是一类具有强腐生性和宽寄主范围的真菌，高水平抗性品种稀少。本研究采用的344份材料包括56份研究常用的水稻纹枯病抗感差异材料、107份抗旱核心种质和181份中国水稻微核心种质，经鉴定发现10份抗病品种和82份中抗品种，占鉴定总数的26．8％。发现了一批抗病性较好且在上海、海南两个环境下抗性稳定的材料，如：金糯粘、Tarommolail、SadriRice、黄皮糯、香谷、一支香、饿死牛、三磅七十、饭毫皮、香稻、麻谷糯、金枝糯、乌咀红谷、赤壳糯、鱼眼糯小红谷、山酒谷、寸三粒、安农晚粳、赤壳糯等，这些材料可用做进一步的研究应用。本次实验筛选到的纹枯病抗病品种株高在142cm-183cm范围内，为高杆材料；抽穗期97d-105d，为晚熟品种；鉴定到的病级为4级，呈水稻纹枯病中抗水平；材料较多来自于广西、云南、福建等省份，多为中国南部省份的地方品种。28 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制参考文献1．陈俊宇，王凯，龚俊义等．RFTl与Hdl所在区间对水稻抽穗期、株高和千粒重的作用．中国水稻科学，2013，27(2)：117．1212．陈宗祥，左示敏，张亚芳等．水稻抗纹枯病QTLqSB．9硷和抗条纹叶枯病基因Stv．b7的聚合育种．作物学报，2012，38(7)：1178．11863．邓其明，王世全，郑爱萍等．利用分子标记辅助育种技术选育高抗白叶枯病恢复系．中国水稻科学，2006，20(2)：153．1584．付冬，陈亮，刘毅等．利用F2群体对深水稻抗纹枯病QTLs定位．上海农业学报，2012，28(1)：55．595．付央，苑冬冬，胡文静等．陆地棉背景下海岛棉第18染色体片段置换系的培育及相关农艺性状QTL定位．作物学报，2013，39(1)：21．286．高清松，杨泽峰，徐辰武．水稻基因组进化的研究进展．扬州大学学报(农业与生命科学版)，2009，30：34．447．高晓清，谢学文，许美容等．水稻纹枯病导入系的构建及抗病位点的初步定位．作物学报，2011，37(9)：1559．15688．郭梁，张振华，庄杰云．水稻抽穗期QTL及其与产量性状遗传控制的关系．中国水稻科学，2012，26(2)：235．2459．国广泰史，钱前，佐藤宏之等．水稻纹枯病抗性QTL分析．遗传学报，2002，29(1)：50．5510．韩月澎，刑永忠，陈宗样等．杂交水稻亲本明恢3对纹枯病水平抗性的QTL定位．遗传学报，2002，29(7)：622．62611．黄世文，王玲，王全永等．一份抗纹枯病水稻品种ZH5的抗病虫特性和生物学性状．中国水稻科学，2007，21(6)：657．66312．李芳，程立锐，许美容等．利用品质性状的回交选择导入系挖掘水稻抗纹枯病QTL．作物学报，2009，35(9)：1729．173713．李宏．植物抗病遗传育种中的QTL定位和克隆．亚热带植物科学，2011，40(3)：87．9214．李慧慧，张鲁燕，王建康．数量性状基因定位研究中若干常见问题的分析与解答．作物学报，2010，36(6)：918．93129 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利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制qSB9—2andqSBl2一J『，forricesheathblightresistance．MolBreeding，2012，30：293—30386．ZhengAP，LinRM，ZhangDHeta1．Theevolutionandpathogenicmechanismsofthericesheathblightpathogen．NatureCommunications，2013，10：1038-104387．ZouJH，PanXB，ChenZXeta1．Mappingquantitativetraitlocicontrollingsheathblightresistanceintworicecultivars．TheorApplGenet．2000，101：569-57388．ZuoSM，Y'mYJ，PanCHeta1．FinemappingofqSB-11Le,theQTLthatconferspartialresistancetoricesheathblight．TheorApplGenet，2013，2：1007-101235 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文致谢本论文是在导师罗利军研究员和陈亮研究员的共同指导下完成的。罗老师渊博的知识、求真务实的科研作风和丰富的人生阅历是我终身学习的楷模，陈老师耐心的教导、严谨的治学态度和平易近人的品格给我留下了深刻的印象。课题设计、实验安排和文章撰写过程中都倾注了老师们大量的心血，在此谨向老师致以诚挚的谢意和衷心的祝福。上海市农业生物基因中心为本次实验提供了良好的科研平台和技术支持，本人在开展课题实验过程中，得到了诸多老师的关心和帮助。感谢指导小组梅捍卫老师、刘灶长老师、余舜武老师、刘鸿艳老师提出的宝贵意见，感谢吴金红老师在实验试剂订购和实验室管理上辛勤的工作，感谢葛国军、熊良等基地员工在田间试验中的大力支持和协助。感谢我的师兄柯亚光、郑小国、陈守俊等，我的同级柴煜，09级的赵洪阳、马孝松、聂佳、徐妲、马瑞芳，1l级的张卓一、张余、王培，他们在我的实验过程中多有交流和协作，陪伴我共同成长，在此向他们表示真诚的谢意。感谢华中农业大学和上海市农业生物基因中心给我提供良好的学习环境和先进的实验设施。感谢我的父母对我学习的默默支持和关怀。最后衷心感谢所有帮助我的人，谢谢你们136党慧2013年4月 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制附录附录I植物DNA提取步骤附录卜1大样法(改良CTAB法)1)剪取新鲜幼叶29，在液氮中研磨成细粉；2)转入50ml离心管中，加入10mL65"C预热的2×CTABDNA提取缓冲液(含201xLD．巯基乙醇)，涡旋混合均匀，于65℃水浴30min．1h；3)稍冷后加入10ml氯仿／异戊醇(24：1)，室温下振荡20分钟，4000r／min离心20min，将上清液转入一支新的50mL离心管；4)重复步骤3)，至两相界面干净，上清液转入一支新的50mL离心管；5)加入10ml或等量的异丙醇(-20"C预冷)，轻缓巅倒混匀后于．20。C放置1h以上或过夜，4000r／min离心20min，弃上清液；6)用70％酒精冲洗沉淀物2次(5min／次)，倒置离心管，空气干燥DNA沉淀；7)用5mlTE缓冲液溶解DNA沉淀，加5此RNA酶(Invitrogen)，在37。C水浴30分钟或过夜，消化去除RNA；8)加1／10体积3mol／L醋酸钠(5001xL)和两倍体积无水乙醇，于．20。C冰箱过夜，4000r／min离心20min，倒掉上清液；9)70％酒精冲DNA沉淀2次(5min／次)，95％酒精洗1次(5rain)，室温下空气干燥。再用200斗LTE溶解，转入1．5mL离心管低温贮存待用。附录卜2小样法1)剪取新鲜幼叶29，叠竖放入2ml离心管中，再放入液氮中冻几秒中，镊子夹出用玻棒捣碎；2)加入1．5xCTABDNA提取缓冲液800pL，56*C水浴30min．1h，中间摇匀3．4次：3)加入等量氯仿／异戊醇(24：1)(8001aL)，室温下振荡20分钟，12000r／min离心10min，将上清液(吸取6000L)转入新的2ml离心管；4)加入2／3体积的异丙醇(-20。C预冷)(400I-tL)，轻缓巅倒混匀后于．20。C放置lh以上或过夜，12000r／min4"C离心15min，弃上清液；5)倒置离心管，空气干燥DNA沉淀；6)用2001上L的灭菌双蒸水(含有5mg／L浓度的RNA酶)溶解，在室温或370C消‘37 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文化lh，放置4℃冰箱贮存。附录ⅡSSR反应体系和扩增PCR反应体系：PCR反应程序：10xPCRbufieo2mMdNllP10州forwardprimer10州reverseprimer25ng／pLDNATaqDNApolymerase加ddH20至总体积94℃5min94℃30sec55℃30sec72℃1min72℃5min10℃hold2此1皿1此1灿2此0．4U20此35cyclesPCR反应在MBS0．2STheroHybaid热循环仪上进行。反应结束后加入5止6x溴酚蓝上样缓冲液待检测。附录Ⅲ电泳检测附录III-1琼脂糖电泳检测如果亲本间扩增片段差异较大，带型差异较为明显，可用高浓度琼脂糖制备含EB的琼脂糖凝胶(3％)，加入8此PCR反应产物，以120V电压(5V／cm)电泳检测。用紫外凝胶成像系统记录电泳结果。附录1-II-2PAGE电泳检测1．电泳溶液配制(1)5％变性胶的配制(50mL)5％acrylaminegelsolution(Acrylamide／bisacrylamide(19：1))TEMEDfN，N，N’，N’-tetraethyl—methylenediamine)10％APS(freshprepared)(2)银染试剂配方染色液：29硝酸银溶于2000mL双蒸水。3850mL60止600此 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制显影液：O．89无水碳酸钠，409氢氧化钠，溶于2000mL重蒸水中，4"C预冷，用前加入8mL37％的甲醛。2．PAGE电泳对于琼脂糖凝胶上不能区分多态性的PCR产物用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(PAGE)进行多态性检测。实验步骤如下：(1)玻璃板的处理用清水将玻璃板、胶条和梳子洗洁精反复擦洗，然后用清水和蒸馏水冲洗干净，置于实验台上中晾干备用。1)长板玻璃的处理用95％的酒精轻擦2遍，晾干。配制亲水剂(95ml无水乙醇+500btl冰乙酸+4．5mlddH20)，用Kimberly．Clark@纸巾沿同一方向将亲水剂均匀涂布在玻板上。2)短板玻璃的外理用95％的酒精轻擦2遍，晾干。用Kimberly-Clark@纸巾沿同一方向将疏水剂(95ml无水乙醇，5ml甲基丙烯酸十二含氟庚酯)均匀涂在玻板上。(2)组装电泳槽将处理好的短板玻璃平放在实验桌上，把胶条放置在短板玻璃的两边，小心的将长板玻璃扣在短板玻璃上，两边用夹子将两块玻璃板夹紧。(3)灌胶将组装好的玻璃板平放于桌上，沿长短板间隙缓慢将50ml变性胶溶液倒入玻璃板内，待胶液流出顶部后插入梳子，聚合30min。(4)电泳1)预电泳：将电泳缓冲液分别加入正极电泳槽和负极电泳槽中。缓冲液液面一定要超过短玻璃板上沿。140W恒功率电泳至玻璃板温度上升至45．50℃。2)变性：样品于94"(2变性5min后，立即置于冰上。3)点样：取出梳子，冲洗点样孔，加入2-31上L样品。分两次次点样，每次间隔时间为30min，每次点样前冲洗点样孔沉积的尿素和气泡。最后～次点样结束后，140W恒功率电泳1．1．5h。(5)银染采用简易的银染程序，方法参照许绍斌等(2002)。1)清洗：电泳结束后，小心分离两块玻板，将长板玻璃置于盛有适量蒸馏水的染色槽中，轻缓振荡清洗15sec；39 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2)染色：将玻板置于2L染色液中，轻轻振荡15min；3)冲洗：双蒸水冲洗胶板不超过lOsec。4)显色：将胶板迅速转移到2L预冷的显影液中，轻轻摇动直至条带出现，颜色不再加深。5)清洗：用流水清洗多余的显影液。6)干燥：室温下自然干燥后，记带，数码相机拍照。 利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制附录ⅣC418导入系基因型图1C418／BR24导入系基因型。绿色：C418，红色：BR24，蓝色：杂合带型。FigurelGraphicalgenotypesofC418／BR24intergressionlines．Green：C418，Pink：BR24，Blue：heterozygote1+o．1tom'’Z1dlfomr3："auom3。'o—————————●——————■——一■—■■———■■l2口■——■—■■——■—■———————■I——————■■—■3口————————■I——瞄■■———-—————■—_4．0■————■嘲瞳曩■———————一———■—■———I}O———■—————一●——■■■■—■■一———————■一S0———■————■t■■——————I—一———————■—●功——————■—■H—■————■_—■■————一¨———■—■■■—I——■■———■一——■—■——_复O——■—■————■●■—■■鞠—■■一■■——————■●'0■————■————■I■———嘲鞠嘲■—_■■—■■————l'1~．——■■■———■一■■——酯嘲—■■■—■■—————一'20—————■■—■■—■——嘲————一■——●————一，3●———■——■—■■■■■■———■一●■———■——■■¨量——■——————一—■—■■——■——■■——————■—l，S口———■—■—■—一——■—————■—I●—■—■————■{eJ—■—蹦—————■■————————■——■——————■’7J—■■—囊———一—■——■———一——■———■—_●l釉—■———■———I■—■—嘲——一——■■———_{寻一————■————I—■■—目嘲ILI■I—■■■■——■一嚣量■■—■■——-一■■—■嘲———■—■———__郅一——————■—■——■■■■——I——————■—-笼0●—■■—■———I■■●——■——一——■————_2量0——■■———_—————■■_■—■■■■■_篇一■■—————一——————_■一一IIIIIIIlL+■一篱0—_II■——■_■——■———■_———————■一270——————●-——————●—一——————■一2&0——■—■————■——■嘲■———一——■———■—一嚣0■嘲■———■■一■—■——————■———■—■—_∞-口———■———■———鞭嘲——■■—■———■■—I3'．口■■■———■—一—■■—————一———■———■■32|O■■——■——■■■■■—■■■■—_■■—■—■■—■一330—■■■■—■■—■I●——■■■—■■—■■■■—■■——I■■3‘口■—■——●—一—■——■—■●■l■■■———一篇0———■■———_————■■■——■liIIIIIII—■_1II———■————■■————崩嘲——■■———■■—鞠黼_36．0—I37口————■————I■■■■——■——■■It__—■38．O■一I—————_■————————_●————■——一3童O■———■————l●■■——————一————————一柏膏—————■———I———————■—l——■—■—■一4lm—————————I●————————■—■—————■■旺口■————■■——I—II_———————_43,0■■■■————■■■——■黼■—■■■—■■—■■■■■■4●曩■—■——■■——■I■■—嘲嘲■■——■■■—■■■■■■■■I45●■——■■■■■-■■■■—■—■_■■■—■■——-碍曩——————■■—————■■一——————■-●7量■■■———■—■一●■■■■—————I—■—————■一醇．口—————■——■—l■■————■——■一——翻—————■■■则———啊■————■I糕——■——————一lI"IIlIIII．【5¨●■————■■—一——■—————_UIIIIII”J————————l●——————一——————．—_一+黝————●———■■■■—————■_■——■—————■渤■■———■—■■纠———————一—■—■———一H鼻——■■———一——■—■—■—■■■■——■■一SSm●—■■■——■—●蠢——■—■———■-——■■■■———■5矗O———■——■——一—■■■■———■_—————————IStO●Jllllll——————■■————■——■—t■—————————I5＆O■—■——■■—■一——■————■■一—■—■■————■5龟e—————————一■—■——————一—■————■—一罚膏————■————I■————————■———————●—●号I冉—■————_，qII——I————————一6王O————■■黼相一—■—————■—l——■————■I叛口■—■■■■——■l—■——■■■■_■■■————■一釉曩—■■■—■—■■■-———一■■■—■■—一砖，●—————■■■—●■II——■lI———■—■l●一稿e———■■—■——●lIIIIII——■●I——————■■l钌O———■—■■———蹦—■———————一●■——————■一鹞曩一IIIIIIIIIIIIII+I■1IIIIII++—一曲量■—■————■—●———————■■一■—■——■———I7乱●———————■—●l—■■●■——一JIIIII————————●co哺棚d—端嘲—_嘲褂■——嘲—■—●一——_■-—_4’帅fnrS：蚀f㈣r6_瑚mm6．7．xchf4wn7-■■●●■‘■■—■—■■■f誊■●●—■—E■●———■i簟n—■————一———鞠■——■■——瞄■——-一n—■————■一———————一————嘲■—一———■■■■———————I——————■■111111111411111111n——————_■—■———_——■啊———一■■—■—一————■■一u——————_n■——————肇————■——■●————■——■m■————■_u■————■_■■■■—麟翻■■——■黼曩■————■■一■————■■■搿——■■■—E囊翻—■—■—■I—翻■■■—■_————翻■■_m●■—————■I■■■—————I——————■—■n■■■■■—_—■●—■■———-●●●——■—■■—●n——■————一——●—■——-●——■————■●—■——一●■—————一——————■_——■—■—■_——■—■_m——■————■——————■■I■————_鞭——————蠢■瑚■————群——曩嘲■—_n辅———■——群■嘲鞠———■I■嘲嘲—■■—一nm■—————_——————一nm—■——■■■簟———■—■■一■—■■■_■—■■—■■■■■■—■—_■———■■_■■——■_—■■■■—■一■—■■—■■一llllllllltllllllll囊■———_——■—■—■■■■——■■■—聱囊■—■■一iiiiiI■—■——一囊—————■■——————■一■■■鞠——_■———■■■■—————■—I——■■———■—■■翻———一nm——■————●■■———————t—————一———■—瞄_———■——_■—————_—————_lllllllmlltlllllllllm———————■———————一—■—■—_蔫——————赫■———■—_—■■———_■————嘲I■■鞠—嘲嘲嘲l—鞴鞠嘲———■舞榭辅娜———■m——■■■■—雌■■——■■_●————■■■●■■■—■_——■■——_■■■■■—-■■■■—■—一—————_—■■■■—-■■■—■—一■—■—■—_nm●—————■一●—■——■—一■————一■——■■■■■—————■—■■●—————一nlllllllmlil+llmmllllllllll-■——————_■—————t●————■■一——■瞄——嘲—I——■———■—n———■—■—I——■■———■—————■■一—■———一m■—■————_————■———一●■———一—■■———_—————■—l●———————■■————-■囊————■一—————■—I鞠■—■——■一—————嘲■———■■■■——■——l{iiiiiiiiiiiI■■■■■_llllllllllW_mlllUlllllll)llm■———■_mm■■■—■—一■■■■—一—■■■■—_■—■———I_■■■■———-—■—■■——一■—■—■■■■■■■———■_———■—■■一n——————_———■———一———————一■■—■—_鞠——————l——●■■——一■■——————●—————_————■—_mUlmlnllll一—■————黼■——■—一nm———————一————一——————一m———■——一————_mm———■——一nmmlllllRluuluulmn■—■—■一——■■——一翱—■■■■—■■■●■■■——一————■■一鞠———■———lmllllmllllllllllllm———■——●一———————一■————■■■Imlllmllllllllll_l■——■■一簟—————一■—■■—■_■——————-n蕾—■■■——■—————■—-一———■—■—一———■■一m—■—————一———————一———■■一■——————一————■■—■■——————一■■———_鞠■————_——————_———■——_■■——_柏群———■一■——■——■I■——曹■——■■———■_■■—■——■●—■■■■■■■■■■—■——一■——■—_■■■—■■一m■————■_nn●——————一●●—————-nn■——————一——●————一●——■——一●——■■■—一mu—■———一———————■—■—■■—菌一————■——■●————_n■——■——■_I——————■一—————一———■■■—一———■——■■I—●———■-■——■—黼——■粥嘲嘲黼l———■—■●—■————_8“dIfOm"ci'Fom9410；’寸忡嘲扩曲fomlI。12：’曲∞m1———一■—————■—_■—■——■-————■瞳—暖■—■糖—————_n——雕———一—■瑚鳓燃黼mmmlm—■—■—黼黛黼—————_——鼎赣鞘辑黼iBiImlm■■——鞲黼群翱_■—■氍—_——棚鞠嘲—_———_—————鞣蔫黼—■———_—■■嘲—■一n——————■翱黼m■————嘲一■——_———■黼精獬n■—————一n●———■_n●———■_—■—■—■一■—嘲_—■■■■喇■■一■—■——_■■■■嘲■_■瞄啊_——■——愀■黼—嘲■瞄—蝴■——嘲鞠嘲黼m—■■——嘲allllm——————_■—■———黼n■———■_■一■———■—一—■■■麓崩黼mmllllllm■————一—一——■———_—————■_曩翻■_———■—一■_■————-■———嘲嘲一———_■———■脯iiiim——————一—■————_m—■—辑—黼■_ImmlllBiiiiim———嘲豳_mmmlR—————群辅黼—■麓翻■_■■■嘲鞠嘲_———_—————一捌_m——■■—■_m——■——一■—一———■■_—■■———一■■—-●———_鞠-—■——■_■——■—_■嘲—_■————■t确_——■—■_■■—■嘲嘲蝴睫n———■——簟mulll—■■■■一■—■鞠锸栩_———_●————_iiiim■■—■■■_————鞠■_NIIIIMIm●■■——_秘_————■_■——■嘲麓黼■—■一—————■■■_—————_■■————一———_iiiiimmlllllmn鞠——■—_●———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华中农业大学2013届硕士研究生学位论文图2C418／Cisanggurang导入系基因型。绿色：C418，橙色：BR24，蓝色：杂合带型。Figure2GraphicalgenotypesofC418／BR24intergressionlines．Green：C418，Orange：Cisanggurang，Blue：heterozygote1’"曲raml。2：‘mrtm口3：。cIIfom3-，h蛹嘲鞲蝻辆嘲商尉知麓—翻雕晌—黼赫嘲嗣谢赫函删2鞘—嘲嘲嘲嘲嘲黼精■嘲嘲嘲嘲嘲㈣—■黼黼嘲■㈧345S7S§，O¨1213¨151617’0鞠———嘲嘲嘲一搿■嘲嘲嘲躺嘲啪鼎嘲嘲黼黼瞒嘲嘲嘲■辅辅鞲礴嘲嘲嘲目嘲譬鞠篇鞠黛鞲穗鞭嘲#瞄《辑罐嘲嘲鞴嘲篇_—蘸鞴鞠舞酾■鞠鞴黼蔫黼黼嘲鳓嘲黼目-嘲《鞴嘲霸嘲鞣嘲黛_■I囊——■——鼎■黛—■——嘲黛■_■麓鞠■—嘲鞠■—_■—囊————■—麟■豳翻鼻嘲删■瞄■峨———■鞠■——翻一捌——————嘲■瞄■■——嘲翻■——■—嘲■—————_鞘翻霸■—鞠蕊鞠嘲黝嘲麓翻嘲赫融鼬■黼■■——嘲鞘嘲—_嘴鞠—稿嘲麓鞠嘲■嘲■■—麓黼■嗣嘲■_■■嘲翻—嘲嘴—∞瞄iwmUlllUllWam㈧■—■—鞴瑚篇啊■_——————霸嘲麓—I————嘲■■■嘲●一●——嘲—嘲——_—一}———■—■—嗣黼鞠啊—■瞄———一．ill'i1,[i黼I舞嘲——啊啊睁—__Ljlljjj．．．．．．鞴翻■疆嘲群鞲黼鞠嘲麓黼嘲辅嘲__嘲擎鞠嘲嘲■黼■嘲_黛●鞠—■嘲嘲麓麓麓辩鞠翻嘲群蚺糍麓穰—辫■—嘲嘲麓暾嘲—■蕾■■——赣翻鞠嘲麟■■■嘲嘲嘲翻雠捌■———嘲鞘嘲■—-——■■■—————l—■■瞄—啊——■_一■———■—■■一伯111'1111111---t—嘲—■■——黼柏鞠■————嘲糖__嘲—黼1111111'I—■-—嘲翻黼“翱蚺■嘲嘲嘲嘲嘲■■■—嘲嘲嘲嘲_■群——嘲霸■嘲—鞠氍22辅鞠躺嘲瞄鞠翻嘲稚——■鞠罐黼曝稿嘲群瓣琳翱嘲喇嘲蛾翻黼21篇寓嘲蹦嘲麓嘲嘲■刚—鞲崩黼嘲嘲嘲■群崩鼬霸喇嘲霸鼎I一“鞠嘲■■—嘲■臻鞠稿辫■嘲翻黼瑚群鞠嘲■黛黼签鞠—嘲——■■■■嘲螺■—■_■■——■黼蕙棚■—■—■■■棚嘲嘲—■—_嘲■—黜■㈧27鞠鞠—啊翻嘲蹦嘲睫■■黛嘲黼赫——■I■搿■■黼■—翻t28辩■■■—嘲雕嘲嘲％翱■——翻瞄嘲嘲—■—嘣赫鞲嘲稿赠翻-嘲箱_■黼嘲嘲鼬m瑚嘲嘲_Ⅻ㈣■■__崩黼∞_■■■瞄_■■l■嘲■■__■■■__黼31鞠—————■—■麓—————■—■—■———栩————_32——————鞠—暇一———■■————-I鞠翻——■■——■蕾∞_—■■麓■■■■■■____■_■■嘲黼34Ili．．．．．．IIIIFII'I■——■麓嘲鞠■㈧3s黼赫黼嘲嘲嘲目啸#黛黼黼嘲嘲嘲嘲臻瓣■黼聃黼I羁_靼霸嘲——■■鞠■————嘲嘲黼■■嘲嘲嘲嘲黼37鞠—■■—————■■—————■■嘲■I■稿喇—■—麓黛一饕描■——■—■㈣■—————■■_——■——■——_掬捌—俐II■———■—■曩—一—■—■—晡■—_,IG————■——嘲瞄■■■—蚺■嘲黛嘲黼—t———瞄麓■—■_¨—■———嘲—翻—I———翻—稿嘲嘲—雕■———燃■■—■■,J2———————鞠—●———■奠穗—■-—一黼———黛■瓣■一鹞——■——■■■_■■■■■黼——_■■㈣44—————————一————■———_■———————_‘5——_IIII⋯IIIIIIIIIIF■■——嘲——_1,6■—■———嘲嘲蠢翱蛹嘲嘲嘲嘲嘲螂■—■—■嘲嘲嘲_盯糊州■黼嘲黼捌■聃聃缎㈧——黼黼黼㈣铸—■■鞘麟鞘黼■■嘲嘲糊擞㈣■■嘲鞘鳓渊艄__■■黼嘲黼■■■嘲■嘲黼■■____∞■_IIIE■—■——删S'—————■■_IIII111111●————————_女·III'"_-—____髓———■■■嘲嘲—I————■嘲嘲㈧■—■翻黛——_“赫黼■■■黼■■嘲嘲嘲嘲■嘲■■嘲嘲鞠_一轱捌蝴■■■篇—■■——■——_———嘲嘲黼％___—■黼_■■■——㈣_——■■黼”-■_■■㈣■__■■■黼■■__嘲一女_■_—_一_____一■_____∞__■__㈣-____㈧__-___∞黼黼JIIII■——嘲嘲嘲黼螂—_黼JIMII■s'———————■_————瞳嘲鞠—-■———嘲—■啊黼∞——————■■■—————_■—■——嘲_∞—■———黼_—m——黼-—■嘲__“———■—黼———嘲—_■——_—一笛——■—啊黼—■嘲嘲嘲黼■——嘲鞠一笛■■嘲—删躺雌■黼黼躺嘲黼_—嘲剿嘲_髓—嘲■黼嘲鼬_■■嘲_嘲㈣■■__嘲㈣曲■_——■■一■——■_㈣_■-__㈧711———■———■—一—■———■———一——■——黛赫翻-7t___■■■_II_■■■m_■_72————————■■————————_■■—嘲————一，3JIIILLULIII．．．．．．I■————瞄—_74崩■嗍I———融黼鞠嘲黼．J"llI'Jllll7s■—_■■黼_————■嘲一—■■■嘲黼c￡嘲蜘d攀鞴黼嘲融嘲目嘲奠蔫——嘲■嘲雕蕾囊■麓嘲嘲榭■嘲■t抽mm矿5ⅫOmF6．．曲附m6’7"okomT"轴妇南翻自鞠畦h黼嘲—■吲黼矿嗡晌妊b■■—耐知■——■●i■i捆—瞳——黼瓣—■隧——_■■聃瞄嘲嘲_■—麓—翻—黼鞠嘲嗣■黼鞠精嘲嘟翱_稍嘲嘲嘲—黼鞠嘲嘲嘲鞠嘲_麓黼嘲蹦黼鞴嘲黼嘲糕嗍翱嘲霸嘲嘲黼翻■嘲艄黛黼嘲鞠嘲赣黼鞠醺鞠躐稿㈣鞠嘲嘲鞠黼黼——麓嘲嘲黼黼瑚■——黼■■囊翻鞠黼—■—■嘲醴_■■—嘲麓■_■■—鞠—_■■■■麓嘲—■■—■—翻■糕■—■嘲嘲霸_糍—嘲———一iII}■——■瞳■■■■■■嘲鞠黼-黼稿鞠嘲——嘲藤崩嘲喊鞠翻—麟榭—麓瞄■■_——■翻嘲■黼辅嘲麟黛—■■霸■鞠嘲■—_—■鞠嘣糍—__■■嘲黼麓——一辅懿■———瞄稿黑鞠翻瞄——■■翻—瞄翻—■■冀——■————l簟—■——_■嘲嘲嘲—_———■——_———■■—_攮———■_——麓嘲啊——■———嘲嘲哺_————翻—_辅■嘲——_囊嘲——■—一■——■氍—_■■■嘲霸瞄_麴嘲嘲嘲㈧赫—鞲嘲■黼■—嘲蛹鞲■黼■—嘲嘲黼嘲_鞭霸嘲鞠嘲_鞋鞠嘲罐鞠嘲■鞠■捌鞠鞠麟蹦嘲黼——霸嘲嘲鞠嘲曝黼蛐嘲■愀嘲蛐嘲嘲嘲㈣—■嘲鼬鼬嘲糕■■■■鞠■麟■■■—■__iFIi||i■瞄—■■_■■—瞄嘲—嘲翟豳——■一——■■■■黼一i■曩嘲■_—■———一lllrlllI鞴—————一■—————_—■—■雕蹦_—■—■—嘲黼甜嘲■皇——■鞠麓黼翻■——■捌精确圈翻■—-■—■翻鞠嘲—黼鞴麓糊鞠—黼鞠麓黼麓翻—黼—■嘲麓魍嘲黼—■麓尊黼翰黼鬟鞠—■—嘲鞠麓鞠崩瞄■_鞠—麓嘲—搿黼——■■穰隧黼鞠■嘲———I蔫—麟嘲鞠嘲—I■搿嘲鞲鞠商■I———瞄■——■翻———■一——睁———_■■——嘲——t■__iiil瑚鞠——黼——黛——黼■—————_————崩■黼锶嘲翻—■—■■簟稿——■■t■———■■■I■—霸黼黼黼—■翱脯嘲麓—黼翱翻嘲龋■—_■嘲霸■嘲■—■■麓■嘲嘲瞄黼鞠豳■■—嘲翻嘲黼嘲删柚_——瞳嘲鞴黼—■—■瞳搿嘲南黼糕翻——■_霸麓鞠———_捌■嘲———黼一]HII蕾————_■—嘲—瞒囊黼————■—_————翻■—一n■麓鞠———一——————_——■■—黼iiiiiil■嘲翻—_■■■■——_■—■喇——一IJ[iiiiiiiI翱嘲嘲■黼鬟黼黼■—懒翱嘲嘲嘲嘲黼稿—嘲嘲鞠静黼黛嘲嘲■黼瓣鞴鬻霸嘲黼瓣精群鞴嘲精辫辅霸鞴獭嘲黧黼黛■簟豳■_囊黛酬麓翻黼—娜■嘲—龋-■—■霸鞴嘲黼捌嘲鞠——■t■—麓嘲翻■l■■■—■——■■■———翻皤簟■-——■■■—I—■■—■■—■——一iiiiii一■■■—嘲—_捌嘲■—黼鞠—麓———_—嘲■———黼一iiiiiiiiI————_嘲燃渊,ii,i[iiiii一—■—■——_麓鞠嘲——■t麓豫融黼嘲■■*鞠睁黼融嘲嘲瞄_一———■捌嘲■一冀奠瞄——_■群嘲曝嘲—黼赫赫—翱嘲瞳■t———嘲麓黼删撼——■—_■—嘲———_——嘲荫嘲蝴———嘲■黼翻——嘲嘲雕—■————翻■—————一—■—鞠啊—_■——■—_■■—嘲嘲————I——嘲——■一■—■■嘲一麓蔫——■■睡翻麓嘲黼—_■一蔫帮嘲黼麓■_■—■嘲嘲■■_糍鼬∞嘲■黼秘嘲鞠翻嘲黼冀嘲麓嘲嘲嘲黼■—嘲麓嘲黛■一穗《■黼黼描嘲蹦糊黼㈣嗣嘲麓矬嘲嘲_■■嘲群嘲■删翻—■嘲瞳翻l翻■嘲睫■嘲黼翱——嘲啊翻■t—■—■■■_捌■■■—_●■■■——_■■■啊———一————嘲■—-—————_—————■_●————■_———■——_曩啊■——一——嘲鞠——_——■■嘲—_■————■一■鞠麓———一■瞄麓鞠嘲——鼻■■嘲瞄鞠——一■—■曩——_黼謦嘲—■_囊篇隧鬻嘲赣__嘲嘲麓鞠辅赫_嘲■———■臻嘲黼鞠嘲■—㈣■■黧麓酬黼■——蹦■—黼—■—麓嘲嘲一鞠螺鞲——■■捌嘲躺■—■■■l■■—■■■■■—■——■—_鞠嘲—■■黼—■嘲■—■-■—■■■■_■—————一——■■■-—麓麓赣嘲—_■—■啊鞠—一●——————一■—啊——_—■豳嘲嘲_—■■—■——■黼———■———一辅群霸——_稿麓翻嘲嘲黼■瞄豳霸翻—獬———嘲鞠■黼藕黼嘲——_—翻瞄鞴■—黼——麓瞄鞠—_—■嘲翻■■嘲一翱鞠■——_彝■—■——_———■——一———■曝—_翻嘲■—_—嘲嘲——瓣—————_■—————一蔓——■■_囊嘲嘲■——_翱嘲———■_■——■——_赫■——_鞴嘲嘲嘲嘲赫■霸■翻—艄■■—穗麓_黧麓嘲■-■雠霸麓鞘嫩嘲瞄-黛籀睇翻喇蹦嘲翻簟■■螂麟糍麟—曩赫嘲■■■蝴蠲嘲罐嘲童嘲蜮鞠蝌嘲瞄—豳_■—■瞄—嘲峭期蜩■—■—t■—嘲———■—I—■——■■—雕■—■—■—_■嚣■■——■I■—嘲—■——一—■■蝻啊—嗤一————■■■_鞠■■■—_———曩—■黼——■∞麓—嘲一■■■——■——■蔫———■_——■嘲——_——嘲雕■—一—■————一■■嘲———一■—■嘲——■精■■—嘲薯囊—■—■——■喇_掏麓精■黼翔鞠嘲———■■囊—鞠瞄翻—■■■■喇薯霸喇■■l麓嘲■——_鞠嘲秘哺—嘲—一■——嘲嘲鞠嘲■——■肆嘲—_鞠鞠戳嘲㈣■嘲嘲熊嘲黼鞭■蚺黼嘲㈣——嘲■囊—黼8：’℃flrO瞅．"ehrom9。10：。d_帅栅F咖m'r12："OhI'0m1警—h戚■■■黼粼袖嘲嘲溅鬻南■—h藏■■■麟■——■黼撼麒翱嘲嘲嘲黼翱■■■翻黼韵嘲黼辅■■■黼鞭嘲辅嘲鞲嘲嘲黼棵—■嘲嘲黼獭嘲麟瓣翔嘲蔫霸黼鞠黼鼍嘲睇勰辫黼——麓■嘲黼捌嘲黼■嘲嘲嘲黼鞠黼鞫麓霸嘲黼赫——■鼎獬■—霸黼—■■麓黼■_——舅鞠嘲黼鞠嘲■嘲嘲黼■啊—黼■——麓黼期麟鞠嘲嘲嘲黼■■———黼■■麓懒瑚—■—嘲麟囊黼—麓搿麓麓黼——————麟■■嘲嘲翱—翻翻蝴鞠麟——嘲嘲燃赫啊—嗣■黼鞠嘲赫糍嘲——瞄黼帮黼翱鞠嘲嘲黼鞘翻翻喇—黼———麟——■—黼鞠黼——嘲穗麓黼—■■—嘲■隰———_——■—黼辅嘲——■—鞴黼—————㈣■■■嗍■嘲■—_辅黼—■■礴—_—————㈣■雕嘲黼■鞠—■黼●_———嘲嘲嘲翻鞠—啼鼎徽—嚼嘲黼椭麓麓麓㈣鞠黼■鞴嗍黼黼糖霸嘲鞠鞴赫懒■—醚麟搿峨鞠—黼鞲麟瑚■嘲嘲黼黼翻■—麓鞠黼■翻■黼锱嘲嘲瞳幽翻脚■黛嘲嘲鞠雠■■翻嘲黼㈣—嘲瞄黼■瞄躺■嘲—黼■———嘲黼—瞄———■黼—■—嘲描■■—黼■_———瞄—黼—————■_———嘲翱—■—黼—_——■麓鞠黼——————黼■——麟蔫嘲黼—黼确黼■—曝瞄黼燃—————鞠嫩鞠鞠燃翱嘲黛躺黼辅獭翱■嘲榭㈣鞠嘲嘲喇嗣㈣鞠嘲黼鞠——嘲黼—黼翱嘲鼎躺黼——瞄嘲翻黼■—嘲瓣■———■晡弦黼■■■鞲—黼■翻—辅黼黼—■嘲黼■——■黼翱黼—瞄■融啊黼■瞄—鞠暖燃■—嘲臌囊■—啊黼—嘲■—■鞴黼■■■——黼——嘲黼翱■——黼—一■囊嘲翻鞘黼■■■豳—黼—瞄鞘麟辅嘲—雕黼翱黼—■嘲嘲㈣赫嘲嘲■嘲黼翱翻精黼—■辅螺粼鬻黼■—晴麓懿黼——■—嘲嘲黼———黼■蚺—■嗍■黼■囊鞠嘲—_—■—翻——一■——槲囊■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利用导入系解析水稻抗纹枯病的分子机制图3c418／Dhan4导入系基因型。绿色：C418，黄色：BR24，蓝色：杂合带型。Figure3GraphicalgenotypesofC418／BR24intergressionlines．Green：C418，Yellow：Dhan4，Blue：heterozygote1。ct,'oml’2．’d,nom2"》"l：h1．om3’，0■■蠡辅——■叠酾瞄■■■函—_■———■■—一，o——■———一i一■———————_——■嚣糍捌——一，o————————I—■—-I端女捌■■一—■————_4a■—————■—■群勰■■———_—■—■■■_§a黛t鼢∞辅————■■—■■————一■■——■——_en———■——一III。IIIIIIII—■猷揣辅—一70■———■—■■—I■靛—■■■—■一■■舯毓朔——雠Bn—■—■——■—■■镶■■_ii一■■一iiiiiiiI9a———————一■麟——■——■●断——群鼎榭——一●00————————一——雕锵————一■——————_110———————_——————■——■■■——■一iiiiIIIt2a———————黼———■——_I———————一．IIt3■———■—■——l■_■—■———■一．0IIIIII11'M“0—■■————_■————一IIIIIIII。——■——■—一t5■———■—辩糍％——■■————一———■———一．0他O搿铺■——■■—■■———麟赞■■■——■■—■—一17OmIIIIIIII潮■■簟鼢涮■一■——■■——-'s0一II■崩—■雕蹦黼—_——————一Ill●190—●———————一————一IIIIIIIIIII}——■■————_206———群灏嘲_———————_—■———■—-21O———群鳓潮_———————_—■——一IIIIII2，n————_IIIIIIIIIrt翻————■黼■■——一IIIIIIl23a—■——_IIIIII■—————一■———■—_I24a———■——一IIIIIIIV女■———■—一2sO_I1'}镰———■■——■—■————_26a■————一IIIIHII■■—I—■■—■_IIIII}27nIIIIIII————■_■■■■■——■■■—■■—■_28正—■———■—_辎戴————■一■—■——■—黼2'9重—■■———■●■I————■—■_——■——一ii■∞曩———————弹———■—■—■一■———一iiiii31J■————一iiiiiiiil'————————一鞘鞲鞠———■■瓣托量—————㈧iiil黼嘲————黼∞OI___LLIIll|辅——————■l——————■麟$NJ———————一——■————《糯■———■—_笛冉———————一——————I酾■—————一I甜膏———————一■———一IIIIl瑚蛾I———_3j3．o■■峨潞■■——嘲B瓣嘲嘲瞎蕊娥捌_黼—■■—■—嚣目蔫●溉O—■——■——■一—■—■糟鞘嘲■-———■—聃懿镛■●ea————————l■■——暾糊——一———躺■瞄糍—l41o————■攒—■■———————一————■■—_42．0—■■—————■———■———一———————一媳O————■———■—■■———一iiiiiiI■————■—一44o————————一■—————一iiiiiiI■——■——■一4S．O——■——■——■——■————一■—睇＆嘲—黼嘲■46．0—■——■————I■■—■■■——一●—■嘲蝴■黼嘲■●，詹■■————■■●————蹴∞■_——————一II41；．0一IIIIIIIIIIIIIIII．．一"I————■—_曲●一JlIIIIIIiiiirllISO．O_IIllII翱—■—■—■E黼■黼嘲嘲■—■—一鄯曩■———■—■—一翻■黼馘—■—嘲自群崩II一敏JIIIIIIII．．B———■■—_C<．一mell——■■—一l4"dlforn4"5．"chrom5+霞。dl∞“秽7’西∞m_r8："chrorri婚：椿Om矿10：‘dwO删l蝴舯”’12=’嘲tornl■■麓蛹■膏■——■落搿糍—■■■一■■—嘲■黼辅—■一■———■鞠●睡■————_∞■—■—_■■■㈧mlllllllllllm∞l■——■㈧——■嘲㈧■—一-——__■■■一———端㈧■——㈧■I■——_■——■_■■—■㈧■—_■——__■——_—■—■一■———■●■一_iiiiiiiiiI———_——■———一i'1'lJl／*■—一111'———一iiiiiii——■棚——_—躺蹴锄__——愀■辩@鞘剃inlllr燃4—_——__iiiii_IiiiiiiI㈧———一———_誊捌—■—一一iii—■——I———■■自嘲■——■■—■■群i———一——■—一黼馘鼎嘲—一——艄黼《■■■■———■jl!iill●■IIII■■——峨埔■射———■■———一_■tmnlmmmm■■■—一—■■—■■口—■——科艄鞘期——■——一崔糍濑■—■--iiii■_iiii【●■雌liiiiiiiI_iiiI———■■一一ii—■■■■———■一iiiiil—■—■—■■Ⅳ■——■■■—嘲§—■■●_掣■■—_■———_张材—㈧————㈧—嘲_—㈧——■——_■—一●iiiiiiiiiI_■■—一iiI———_iii『∞蝴■——_———■——_—融鬻稍嘴嘲_—————■_■——_———一i■■_———●■一———■——-■——■黼—■黼麟㈣——蛳獭蝴■————一■—_———一一■—■—一————_■■—_————_————_——■——_——一■—■一一——■—一—■——_—————一■—■——一——————一■—■——■—一—■——■——■一I_●———一——一iiiiiiiI——■_—潍■—■——潮———嘲口《秘m———■—■馘——一ii■——■一iiI_———I_———■一———■-b一■■辩嘲-●哑———嗽*—懈蠢瀚蒯—■■一Iiiiijiiiiiii}_iiiiiiiiI潮嘲■■■一iIII●——脯嘲■■—■■■■■—-■■-一■——■—■I——■—●■一■■■-■■—■-一■—■H■—■_■■麟辅一■——_■——■_■_——_————黼■-_■■■_一———一■———_————麟———■燃■—■—一—————_■—_———一mlllllll————一————一l_—㈣————_————_—■———一■—艄———__————一■■●—㈧_■■——一■■■■—■一—■■———●—————■—一———一————-_mmllmmlmm■———_潮■■_■一—■——■●—■—■■■—一—■——■■一———一—■睇黼一_一m,,mmm-m——■■_铺——一■—■—_—————一■———■黼■—一———一_—■——一辅———_mmmmmam———■■_■————_—————脯—■_——嘲黼_————一————_———_——■—_■——■_————一——_■——__———一■———_——懈㈧■■——_—■—■一—■■■_■—_——■一man■■—_■嘲蜘嘲一螂—■渊■———一——一iiiiiI—■—撼㈣■—_■——__■——_■融颤稍一———㈣■——■一■iiii一■——麟槲煳——_———__潮■■■一■煳辅嘲_——_嗍———__—嘲——一———_iiiI■—一■■■一_—■■■雌■■——__■■㈧■■_■酬l目—__■■_■■_mllmllmm目％___■■■■黼■■∞#㈣mmnmma馘—■■—嘲黜—嘲■——一———■—一■—黼—■—黼黼_■■—一■■———_硼——懈———■㈣■嘲———一——_I11'■翻麟㈣mmmlllmmm黼—■■—一■—■—_埔———嘲——■—黼—嘲———一————-一——一糊蝴—雠蝴——●—一————一—————*—————一————一iiiil'—————_————I—————■●一——■一————_——————●—————一———■—一■——一iiiiiiiiiiiil■—_———一_—————l————l—mmmmnm————一iiI—嘲———_—■■■——一———■————一I—■目————●—暾—■——_翻瓣—艄■■嘲麟删■—■■翱麟■■—蕊涮黼—嘲嗍——黼黼嫩■——■_■■■■㈣■■■嗽艄■翱嘲——■—一柚■崩嘲#_■-■■■■—●■■■-—■聃∞∞雌●■—g■■—■一螺懈翻嘲《棚■———黼————一■嘲—嘲㈣———■_黼_iiiil■——黼嘲————一—■—■一■——蹦———_黼rIIIIIII————群黼■—一■——黼揪————一——群潮_●■——嘲————一III翱皤材■嘲潮—————一■—_一IIIIIIIIll'I黼翻■——一——鼎嘲渊————黼——精黼黼■嘲——_————■一——_——嘲㈣㈧鞭■——一—■——黼■—_嘲_—■辅黼辩融》蝌秣嘲—■—一——————■——■■■■—麟g嘲■_■—■—一—■——●一■■——一—■粼删㈧■—翱—_—————_■骷嘲———一㈣■—■—一———■一■————■■■——一I一辅———辫篇麟■———敞嚆猕—群日_■■———一mllllm————一—■——l一————II精———一iiiiiiiil|iiIIIIIIIII——————一■——一■——_∞■一■——一iiI■——麟_■■—■一JlII—■—一II瞳—■—揪_mlmmmm,—_IIII■——黼_■—■■_一lra■——麟■-■一IIIIIIII《■——■■一———■■-jiIll●■■—■■一■—一■iIllll一—■——_■—精崩-—■■■■粼————■_—■■—■_■■一●ii[IIllII■-■■■—一■■——_—嘲撩㈣——■-黼■■——__■■—_■—_——■一_———■一■■—■-■雕——一■————一—————一——■——一—翻黼——一II'I_——■■_■—黼嘲_———黼—■—■㈧—嘲—■■一_—■—一——_●——一黼●———一—■——_43 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文图4C418／滇屯502导入系基因型。绿色：C418，紫色：BR24，蓝色：杂合带型。Figure4GraphicalgenotypesofC418／BR24intergressionlines．Green：C418，Purple：滇屯502，Blue：heterozygote1．勺'lroml’2：。曲rOmr3：’dlromL3’'O——■■—鞠嘲嘲翻■辅——翻———■■t■—■———嘲啊喇2o■嘲——嘲■—■■I■黛——————■●冀—■———■鞲_3o藕翻—搿————■睡—■■—■—■—_—I————————_—I●o鞠蚺嘲—嘲—囊—瞄■I■■躺—■■——■■锋————■■■—瞄■■So捌翻————————I■■—■——————■———■■———一BO●—■———鞠■——I——————————■———■———■黼7o赫■鞠—■—————I—■———————一———■————_80■————■———鞠¨—————————■■—■——————一90——■—鞠————■—————————一■—■——————一11．o■■————————l■———■————_————————一12o—————■—■——H————■———■—■■———————_130鞠——■———麓■刚—————■———I——■———■—-'‘m赫赫——————■■LIIAL．．_irllIIIII————黼'So捌麓嘲—■■———I■■■—■—■——■■■■■———_—一'e0冀麓—■霸■——■一——■————■-—IF—■——■'70渊嘲—■—■——一——————■—■■■■———蕾——一悖o■II—■■———■———■——■——一————■————一∞O—————■赫靠辅————■——一■■——————一2'O———————■■脯一rill'_■—■—————_嚣膏■嘲_———■I——————■一■———■———一240翻■———■——■孵—————————簟—————————l2"50iiiIIII——■■■———■—————■—瞄■■嚣O瑚嘲嘲■———鲥■————■■■■lI—————嘲■270—■—■——■—■一■——嘲—————■●■■■■——■■—■I箍O———————■■—I■■■———————●■illlIIII]I∞o辅—■■——————I————■————_一■—————■—■一∞o鞘————■—_囊■■———●■一———_——■一31o————■————一———————■黼——————■—_越O■——————___嘲————一——————■一∞O■——■——■_■———————一IIII————■■3l且篇嘲■—瞄—■■棚——■■———一■—■—嘲—簟—■35冉■■■■_■■曩獭—■—■——_■■■—■赫■糍36舟誓■■—■—■■—■■———■—■■_■—■■——■—_370■■■—麓蚺■■_—■■■■—■■_———■■■■■■■∞0糊_嘲■■——●—■IIII]／■■一——————_390鬻■—■—————■————————一IIIII——————_400譬■————————I●—————■■■_———————■_‘IO————————黼l■■————■■一——————■■—一‘2O鞠—■——_—■■—■—————_—————_—一430—————————一——■———■—_—■—————————一“0——■■■——_■■————__——————■_15O—————■■_lI———■■■—一——■————一,16．0■——■—————●■■■■—■——■_——■—■■——_稿冉■■●■—■■■■—I■——■—■—■—-■I■■■——■■—_鹅m———————■——I—■—————■—■■————■———一∞0●————■—■■一—■———■■—■—一——————■—一5’O■———●—■■—一—————————一—■——————■一S3矗■———■—■——_———■■■■■—一————————-—■,51舟—————————一—————————一———■●—■—一为O_■——■—■嘲——■■-■■一—■■■■■■■560IIII————————一——■——■■■l_一—■———————■轷0■——■■■—■■—_I———————■■—■■■———一鲳0鞠————_—■———————一————_—■一鞴O———————一——————■_—————■—一600■—————————¨————■—■—_■———————_钟0—————————■—■—■■■——■一——————■—一髓0■——————■——————■—一■————■■■一∞．0■■——■——■■———————■_————■—■一钳0———————一■—————●—一ijII[1lllllll■艇——■—■——■■—————■一■———■_—．_0一耱0-——■■——_IIIIIIII——_———■———-670——■■——■■—■I■■———■———一————■■■—_髓心—■■—■■——■—HIIII——■——■■■■■—■一S9矗■———————_———————■—一—————————一700——■——————一—————————一———■—————■I71O——————————I■————————一————————■I丸0瑚■—嘲—_—一—————_——一———■———一730—嘲—————■—譬——————■—_—■—■■■——一Hm_■—■—黼——————_■-—■———■750_iiii_v_—ii———一———■—■—一—■■■———一76m精■—■—■■——■I—■■■■■■■——鼙■■—■———■_770■—■■——■■■■H——■——■■■_■——■————_780——————————I■■——■■———一——■—————_700—————————一■■—■——●——一——————■——■髓0■—鞠嘲嘲—■■————————■_■———_■一Co^§∞“舅瞳——嘲鼎穗精—■——————-—麟—————精嘲■一4：’口ltom4’爱铺mm5’6、。ctI怕mr7。咖mr鞠■啊嘲■醐#嘲礴篇鞠翻黼鞠—哺黼嫦翻懈霸嘲鞠■丽嗽黼霸黛■稿鞠嘲鞠嘲酾嘲喇黼黼鞴赣黼嘲嘲嘲黼樽螺嘲■篇篇黼捆鞲嘲—嘲麟鞲嘲嘲麓翻瞄黼簟■嘲■——黼瓣嘲鞠鞠鞴鞠—黼鞠嘲嘲嘲嘲黼瓤嘲嘲聃嘲鞠黼麓—瞳嘲翻嘲嘲雌鞠嘲囊翻鞠麓鞠黻鞠瞄—鼻翻黼———■■—黼—■—嘲■嘲—麟e,lluuillwmJmmn—————㈣■■—翻喇—删IIIIIIIBIIIB／R■—■———■黼——■——脯——麓———_翻—■—●●_—曩———嘲嗍—————_————霸■_———————_——■—■嘲—_————麓_——嘲■雕嘲黼—————嗣黼■————嘲黼—————一———翻啊鞠黼IImlMIImllllnR—■■麓翻——黼—■———_鞠■瞄嘲鞠麟黼羽—————黼————嘲—黼—————一鞭■翻■麓麓黼鞠■——■—艄精■嘲翻鞲嘲黼■舞■嘲嘲翻一鞠—嘲—螭精黼麓翻■氍嘲■麟—■嘲嘲■瞄黼囊翻■■麓—■鞠黼嘲嘲■螺蝴嘲————■黼—嘲■■嗣■黼———■—_鞘麓黼鞠翻麓黼———■—鞠黼■—■—嘲—黼——■—■—■—■————_—■■—嘲———■-tllnlllmllmm■■■—■_————■—一●———霸—獬—————■黼■—啊——-■————■—瓣●——鞠啊——_—篇—■鞠—曩脯——鞠——_—啊————黼辅■—瞳———_■—■■—瞄翻黼■————_■—■■嘲■㈣鞠嘲—鞲瞳嘲—啭■—■嘲嘲■_—赫■——一■■■■鞠嘲黼鞴■瓣■■嘲黼——麓皇瞄嘲黼————嘲翱黛■霸嘲黼螂嘲麓—鞠翻黼精翻嘲——囊黼捌嘲蚺嘲■黼鞠嘣籍黼髓嘲黼冀躺麓奠麓■糊靠—强■黛—黼■■麓—嘲黼■■—蛹—捌黼■翻硝翻翻嘲嘲_———■翻■嘲—皇■啊———_■————翻蝴——翻—啊嘲瞳脯鞠—啊■———■■———啊—黼■■啊———_———瞄鞠嘲鞠懈鞠—■————燃————■黼IMmMiiiIiImmIIIIIllmftiNm——嘲———㈧—————黼—蔫■喇■—_—■——■瞳嘲脯鞠翻喃————州—————_■—————一■————翻黼——————黼—————_■—嘲—■■嫩———嘲—嘲—_■—霸嘲■■—嘲——嚏—■嘲■嘲■瞄嘲嘲坤冁■嘲嘲嘲静鞠鞲黼赫鞠嘲■翻啸嘲嘲■■—黛黼捌螺嘲嘲嘲㈣—嘲鞲嘲鞠■冁搿鞠嘲嘲嘲嘲黼■■—鞴—_嘲翻奠辅嘲嘲蝴iiimmlmliR■■鞠越嘴翻黼疆——翻—_獭■■■翻■■脯鞠嘲麓嘲柏鞠■■曩■■■■—∞嘲露辅——■■_●i——曩—嘲黼——■翻——黼■——■——_■———■_—■■—■—黼———瞳——黼稿———■——_————㈧—嘲■—艄i嘲li——■—㈣翱—鞠——_■————㈧■鞠■———_————■■黼辅■—■■——_■————黼——穗■麓—_—————■黼辅嘲■———黼—■——■_-[1[tLIJl''1■_————■—_稿■■■——㈣曩翻霸—霸黼■—■嘲—憾_囊—囊—嘲嘲黼舞—鞠—嘲—嘲黼——■■■黼曩——鞠嘲翻—一II'-I'111III■■瞄■—瞄—■———l■翻豳■■雌■————■黼鬻—■■■——峨■—■——簟冀—■■———■■■—_I—嘲—一■II——一I——■■—■-—————_■—奠■瞄—_■——————_—■■■———_—————_——————一—■—————一———————一—————_——————黼■■■————_———————黼—■■——_WII"I''i_———■———_■—●—翻■—_—————一———■——_——————一———■——删■————_-]LLIIL_IIIl■■—■——_■■■■—■煳—■———_—■——■—一lirJil．《——————一赫—■喇—_j'11■——嘲目嘲-——■—嘲_■IiI■■■————一■■———_——————_■■—翻—■嘲——————一———■—_———嘲—■_——————■_———————_■————_————嘲—_■—■————_———————_—————一———翻■—__I————_———————一————_———■—黼一II———删精————_—————_——舞—■—一————■—_精嘲■—■—一——————一一I———■鞠■一捌——————■撩——瞳■——一————一{JJIII]1IlljL．髑■■—■嘲_翻—嘲嘲■—聃——■■—_■—■■董—_■—麓■—■_■■—■■豳__■■■_l___㈣■__■__II■_■■———_jfII■■———■——tIIIIIIII——一■■■■■■—■■■——■■■黼—翻■麓■———●—■———■■一—————一——■—鞠鞠糊■——————一——■————一—————㈧鞠—■———_——————黼■——————_■—■■—_■瞄啊——■黼————■—黼■■————_■■———_—■■—黼翻黼■■——嘲—一翱—■———_l—■■—_■麓翻■■■_—■—■——黼捌—■—■—_—瞄■——一■——■——黼——————_捌—翻翻■—燃—■—■■_■■——■■_■■—嗣■—■一■—————■_—■———__IIIIIJlIqIIII'———_一I—■———一—————_——————雠—————一I一—■———■—■■—————_——————_——鞠——■■_——■————_—————_—————翻黼■'1111III——_———————脯■————㈧■——■鞠麓㈣鞠翰嗣瞳翻嘲—嘴———■■——_8’chmnlg宫’曲tom9’10：'lI：hrornlltT'oh∞omll‘12：’曲琦m1鞠■麟黼翻■■嘲赫黼鞫黼m膏■■■—■喇晡栩离霸瓣———麓■黼—熊鞠叠—嗣—黼—————嘛赫——一鞠嘲—鞠黼蔫黼精黼赣—翻_■瞄麓鞲鞠黼嘲——一霸——■黛黼鞠嘲捌鞠翻—鞠嗍■■—瞄崮_—■—黼■—■■—_撼_翻鞠■瞳—嘲■——■∞—_■——㈠—————_—一————■黼—■■■奠■_—■■_■——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