地中海拟无枝酸菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因敲除的研究

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1、分类号：密级：UDC：编号：河北工业大学硕士学位论文地中海拟无枝酸菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因敲除的研究论文作者：李浩琰学生类别：全日制学科门类：工学学科专业：化学工程指导教师：金红星职称：副教授史延茂研究员DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofChemicalEngineeringSTUDYONGENEKNOCKOUTOFGLUCOSE-6-PHOSPHATEDEHYDROGENASEINAMYCOLATOPSISMEDITERRANEIbyLiH

2、anyanSupervisor:AssociateProf.JinHong-xingMay2016摘要目前，利福霉素作为治疗结核病和麻风病的重要抗生素，主要是依赖地中海拟无枝酸菌发酵生产。随着近些年人类社会中结核病的再次爆发，利福霉素类衍生物的需求越来越大。传统依赖诱变育种的方法提高菌株产量已经不能满足当下需求。为此，本文利用基因工程手段，探究了地中海拟无枝酸菌基因失活的构建方法，为构建工业高产菌主奠定基础。为了方便对地中海拟无枝酸菌进行基因改造，本文构建了适用于地中海拟无枝酸菌的三亲杂交接合转移体系，增加了一种将外源基因导入地中海拟无枝酸菌的基因

3、操作方法。以构建的诱导型接合质粒pULVK1-Am-OriT为研究载体，考察了受体菌生长状况，三种亲本菌的混合比例以及孵育培养的时间等因素对接合转移频率的影响。结果表明当受体菌OD600为0.7；三种菌的混合比例，供体菌：辅助菌：受体菌为1：1：1.5；混合菌后孵育时间为20h。接合转移频率最高，可达到7.3×10-7。本文以不能在地中海拟无枝酸菌中复制的质粒pMD102为基本框架，通过酶切、连接插入了6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因前后同源臂，分别构建了带有抗性标记和没有抗性标记的基因失活载体。利用同源重组的方法，通过电转化将载体导入到地中海拟无枝酸菌中

4、逐步筛选出突变株，并通过PCR验证，最终得到敲除了6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的地中海拟无枝酸菌突变株XGYY△G6PDH。关键词：地中海拟无枝酸菌三亲杂交6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因敲除IABSTRACTAtpresent,rifamycinasanimportantantibioticinthetreatmentoftuberculosisandleprosy,mainlyrelyonthefermentationofAmycolatopsismediterranei.WiththeoutbreaksofTBinrecentyears,morerifa

5、mycinderivativeswererequiredtobeproduced.Whilethetraditionalmutationbreedingcannotmeetrequirement.Tobuildhighyieldindustrialbacteria,ThispaperusedgeneticengineeringtoexploretheknockoutmethodofA.mediterranei.InordertofacilitatethestructureofgeneinactivationmethodsofA.mediterran

6、ei,thispaperconstructedamethodoftriparentalmatingforthegenefromE.colitoA.mediterranei.AninducedconjugationalplasmidpULVK1-Am-OriTwasconstructedforthestudy.Somerelatedfactorssuchascollectionperiodofmycelia,theratioofthreestrainsandtheincubationtimeofmixedstrains.Theresultsindic

7、atedthatwhenthereceptorbacteriaOD600upto0.7,donorbacteria:assistbacteria:receptorbacteriatobe1:1:1.5,theincubationtimewas20h,theconjugationratecanbebest--7.3×10-7.Inthispaper,thehomologousarmsofglucose6-phosphatedehydrogenasegenewereconnectedtopMD102,aplasmidwithouttheabilityo

8、findependentreplicationinA.mediterranei,toconstructtherecombi