内皮细胞的分离培养及洛克沙胂对内皮细胞影响的初步研究

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1、内皮细胞的分离培养及洛克沙肿对内皮细胞影响的初步研究Thecultivationofendothelialcellsfromratandthepreliminarystudyofroxarsoneonthecells研究生：刘学专业：基础兽医学导师：张雨梅扬州大学兽医学院2013年5月刘学：内皮细胞的分离培养及洛克沙胂对内皮细胞影响的初步研究l摘要IIIHIIIIMIlllllllIIIIIIUlY2419626洛克沙胂是国内外广泛使用的一种有机胂饲料添加剂，近来的研究表明其能促进人血管内皮细胞生长，存在着促血管生成作用及潜在的致癌风险。有关洛克沙胂促血管内皮细胞生成作用的研究极少，国内未

2、见报道。本研究进行了大鼠主动脉内皮细胞的分离培养和鉴定，并利用MTT法检测细胞活力、流式细胞术检测细胞周期、划痕实验检测细胞的迁移能力，初步探讨洛克沙胂对血管内皮细胞生长的影响。采用大鼠主动脉植块法和I型胶原蛋白酶酶消化法分离大鼠主动脉内皮细胞；采用差速消化法去除内皮细胞中的杂细胞，通过DMEM培养基中加入VEGF和肝素钠进行条件培养，并进行了传代培养和生长曲线的绘制；通过外观形态、电镜分析以及免疫组化方法对分离培养的细胞进行了鉴定。分离培养的细胞呈多角形、“铺路石"状；透射电镜下观察可见分离培养的细胞具有内皮细胞特征的W．P小体；CD3lSABC免疫组化及免疫荧光分析均呈阳性。内皮细胞经

3、不同处理培养6h后用MTT法检测细胞活力。各组洛克沙胂的浓度分别为lO．00州、1．00州、O．10州、0．01州，5ng／mLVEGF为阳性对照，PBS为阴性对照。试验结果显示洛克沙胂及VEGF阳性对照组OD值与阴性对照组相比差异显著(尸

4、0“M)促血管内皮细胞生长的作用减弱。内皮细胞经不同处理，培养6h后用流式细胞术检测细胞周期。洛克沙胂浓度分别为10．00州、1．00肛M、0．10“M，5ng／mLVEGF为阳性对照，PBS为阴性对照。O．1山、1．0“M洛克沙胂组以及VEGF对照组S期细胞数量明显高于PBS对照组；G2期细胞数量低于PBS对照组；而G1期无显著性差异。结果表明O．1州、1．0pM洛克沙胂具有明显的促内皮细胞增殖的作用。划痕实验中洛克沙胂浓度分别为10．00“M、1．00pM、O．10p．M，5ng／mLVEGF为阳性对照，PBS为阴性对照。划痕后，内皮细胞经洛克沙胂处理12h后镜下拍照。结果表明扬州大学

5、硕士学位论文洛克沙胂0．01州～1．00“M范围内，随剂量增加促进内皮细胞迁移作用加强，1．00p．M时促迁移能力最强，10．00gM时促进作用反而减弱。综上所述，本研究已建立了从大鼠主动脉分离培养内皮细胞的方法。O．01肛M～10．oogM洛克沙胂对内皮细胞的增殖和迁移具有明显的促进作用；且在0．01州～1．0州范围内，随剂量增加而增加，10．00gM时作用反减弱。关键词：洛克沙胂；内皮细胞；分离培养；免疫组化；W．P小体；流式细胞术刘学：内皮细胞的分离培养及洛克沙胂对内皮细胞影响的初步研究ABSTRACT3一Roxarsone，anorganoarseniccompand，iswide

6、lyusedinanimalproductionasafeedadditiveallovertheworldanditmayhavethepotentialriskofcancerbecauseofitsangiogeniesiseffectandthepromotiontogrowthofhumanvascularendothelialcellsreportedrecently．LialeinformationisfocusedonthepromotiontogrowthofvascularendothelialcellsofroxarsoneandnoinvestigationWasr

7、eportedinthedomesticnow．ThisstudyWasconductedtoisolateandculturethevascularendothelialcellsofratthoracicaortaandthentheeffectofroxarsoneonthevascularendothelialcellsinvitroWasprimarilystudiedusingthemethodsofMTT，