人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良

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1、中图分类号：R329编号：G201015承德医学院硕士研究生毕业论文人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良IsolationandCultureofFirstTrimesterHumanTrophoblastcell研究生：左彦珍导师：李玉红教授学科专业：病理学与病理生理学所在系部：基础部研究起止日期：2011年9月-2013年3月论文提交日期：2013年3月目录中文摘要…………………………………………………………………1英文摘要…………………………………………………………………4英文缩写……………………………………

2、……………………………8研究论文人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良前言…………………………………………………………………9材料与方法…………………………………………………………9结果…………………………………………………………………12附图…………………………………………………………………14讨论…………………………………………………………………17结论…………………………………………………………………19参考文献……………………………………………………………20综述……………………………………………………………

3、……22致谢…………………………………………………………………30个人简历…………………………………………………………………31中文摘要人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良摘要目的：滋养细胞源于胚胎外滋养层，生长迅速。在胚囊表面形成许多毛状突起，称之“绒毛”(villi)。滋养层最早由一层扁平立方形细胞构成，到绒毛形成时逐渐分化为两层。内层与间质接触，称“细胞滋养层细胞(cytotrophoblast)”；外层与子宫蜕膜接触，称“合体滋养层细胞(syncytiotrophoblast)”。滋养细胞通过侵袭子宫内膜、

4、肌层及螺旋动脉，而建立子宫胎盘循环。所以说人类胚胎的成功着床、胎盘的形成、胚胎的生长发育，与滋养细胞的增殖分化以及侵袭功能密切相关。胚胎的植入过程需要滋养层细胞对子宫基质的侵入，源自胚胎原始滋养细胞的绒毛外滋养层细胞发挥类似肿瘤细胞浸润的特性,通过其侵入子宫基质将胚胎粘附于子宫壁组织,并伴随胚胎逐渐发育完善。但是不同于恶性肿瘤，滋养层细胞的侵入过程中一系列复杂的彼此关联的事件受到严格的时空调控。若发生调节紊乱可导致一系列的妊娠相关疾病，如侵入不足会导致自然流产、宫内发育迟缓、先兆子痫、妊高征等，而过度的侵入会导致妊娠

5、滋养细胞疾病（gestationaltrophoblasticdisease,GTD），如葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒癌及罕见的胎盘部位滋养细胞肿瘤等。对这些与滋养细胞相关疾病的研究，需要滋养细胞体外培养模型的建立提供重要的实验基础。目前滋养细胞的体外模型主要有原代滋养细胞和滋养细胞系两大类。人滋养细胞系有：SGHPL、TCL-1、JAR、JEG-3、HTR-8/SVneo、BeWo、SM10、TEV-1、Rcho-1、HPT-8等。滋养细胞系操作方便，但是任何一个滋养细胞系都无法完全替代原代滋养细胞。滋养细胞原代培养方

6、法操作繁琐、产量低、纯度低、临床取材困难，限制了原代滋养细胞的实验研究。所以寻求简便高效的原代滋养细胞体外培养方法非常重要。人早孕绒毛中包括合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞、红细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、子宫基质细胞和蜕膜细胞等。而细胞滋养细胞是各型滋养层细胞的备用库。国内外关于滋养细胞原代培养的方法有一些，但是由于细胞滋养细胞在胎盘中所处的位置，采用不同方法所得到的细胞数及纯度也各不相同。建立一种简便、稳定、高纯度和高数量的滋养细胞体外模型，可以为滋养细胞及相关疾病的研究提供重要的实验1中文摘要基础，促

7、进滋养细胞及相关疾病的研究进展。方法：1取材无菌条件下获取新鲜的人工流产正常胎盘绒毛组织一至两例，孕龄5-8周。2分离用含青链霉素的冷PBS冰上冲洗三次，眼科镊去掉明显的血块。完整的组织直接放入无菌的小青瓶中，加入含EDTA的胰酶和胶原酶，置于37℃温箱中反复消化，终止，取上清。至镜下观察绒毛外的滋养层细胞已基本消化干净，肉眼也可看到残存组织绒毛部位多呈白色纤维状。收集3次消化的上清200目筛网过滤，离心，弃上清，重悬。3纯化将分离所得细胞悬液加入预先铺好的60%percoll、35%percoll液的15mL离心管

8、中，离心。吸取60%percoll与35%percoll分离液之间的云雾层条带，离心洗涤两次。最后用含20%特级胎牛血清的DMEM/F12重悬，5台盼蓝染色，调整细胞密度为1×10接种于培养皿和多聚赖氨酸铺板的无菌盖玻片上培养。4传代胰蛋白酶消化传代5细胞倒置显微镜下观察培养的细胞直接在倒置显微镜下观察并拍照6滋养细胞纯度的鉴定新鲜早孕胎盘绒毛