传染性法氏囊病分子佐剂靶向提呈亚单位疫苗的研制

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1、InfectiousBursalDiseaseTargetedMolecularAdjuvantsonDevelopmentofSubunitVaccineMaster’Sdegreecandidate：HanXiaoyingSupervisor：Prof．ChengDarong—YangzhouUniversityJune20韩小英：传染性法氏囊病分子佐剂靶向提呈亚单位疫苗的研制中文摘要传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的以破坏鸡的中枢免疫器官一法氏囊为一种高度接触性传染病，主要会导致鸡的免疫力下降，进而对一些病原的易感性增强，并导致一些

2、疫苗免疫的失败。VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白，主要暴露在核衣壳的外面，携带了病毒主要的中和性抗原表位，它能诱导宿主产生针对IBDV的中和性抗体，这种抗体能保护易感鸡使其免受IBDV的感染。【T是产毒性大肠埃希菌产生一种不耐热肠毒素，具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性，但是经过基因定点突变后的LT不仅没有毒性而且仍然保持了良好的黏膜佐剂活性。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是活化T细胞的表面的一种跨膜糖蛋白分子，而CTLA-4胞外区能与抗原递呈细胞上的B7配体结合，但不传递负调节信号。因此，用CTLA．4胞外区融合抗原免疫动物，不仅能诱导坚强的体液

3、免疫应答，而且能诱导细胞免疫应答。若将IBDV主要免疫保护性抗原VP2、大肠杆菌LT去毒突变体(In【T)及鸡CTLA．4胞外区基因片段融合，构建通用融合表达载体pET-mLTA．VP2．CTLA．4．MCS—IgV，此融合蛋白能否协同发挥各自的生物学特性具有很大的临床研究价值。为获得细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA．4)胞外区序列，我们根据GenBank发表的CTLA-4基因序列设计引物，利用重叠延伸PCR方法引入了5个酶切位点，构建重组载体pET-CTLA．4．MCS．IgV，然后克隆入去毒大肠埃希菌不耐热肠毒素(mLTA)基因，构建重组质粒载体pET30

4、a-mLTA-CTLA．4，测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导表达后，SDS．PAGE检测时清晰可见约42．5kD的目的蛋白，与预期结果一致，表明重组菌pET30a-mLTA．CTLA-4构建成功。为了构建IBDVVP2融合表达重组菌pET-mITA．VP2．CTLA．4．MCS．IgV，比对GenBank发表的IBDVVP2基因序列，进行基因优化后合成VP2基因，将其克隆入研究一制备的质粒载体pET-mLTA．CTLA-4．MCS．IgV，经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达。SDS．PAGE检测时清晰可见约92KD的目的条带，与

5、预期结果相一致，表明重组菌pET-mI，TA．VP2．CTLA．4．MCS．IgV构建成功，为进一步开发IBDV亚单位疫苗奠定了基础，且经Wbstem-blot分析证实表达的重组蛋白mLTA．CTLA．4和mI，TA—VP2-CTLA-4抗原性良好。为了研究融合蛋白mLTA．VP2．CTLA．4的免疫保护效果以及作为IBD新型亚单位疫苗扬州大学硕士学位论文Ⅱ的可行性，将表达的mLTA．CTLA．4、mLTA。VP2．CTLA．4两种蛋白纯化后进行动物实验，将360只lO日龄非免疫健康雏鸡随机平均分为6组，第l、2、3组用不同剂量的mLTA．VP2．CTLA．4融合蛋

6、白肌肉注射免疫；第4组mLTA-CTLA．4融合蛋白肌肉注射免疫；第5组只用疫苗免疫；第6组为生理盐水对照组。首免后7天加强免疫一次，初次免疫后每隔7天采取血清和粘膜样品，测定血清中的IgG和粘膜分泌性tgh的抗体水平。结果显示，融合蛋白mLTA．CTLA-4对鸡传染性法氏囊病无免疫效果，融合蛋白mLTA．VP2．CTLA-4能够产生特异的抗体，对IBD具有保护效果，其免疫效果与中等毒力活疫苗NF8的效果相当。关键词：VP2；原核表达；粘膜免疫；靶向佐剂；融合蛋白韩小英：传染性法氏囊病分子佐剂靶向提呈亚单位疫苗的研制IIIAbstractInfectiousburs

7、aldisease(IBD)whichiscausedbyinfectiousbursaldiseasevirus(IBDV)isahighlycontagiousdiseaseleadingtothedamageofchicken’Scentralimmuneorgan-bursafabricius．ThisdiseaseCancontributetothedecreaseofimmunityinchickenandcauseimmunityfailurebecauseoftheimprovementofinfectioussusceptibility．VP2