渐狭蜡蚧菌对南方根结线虫卵孵化抑制及其几丁质酶基因lachi1的克隆

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1、万方数据Egg--hatchingSuppressionofMeloidogyne"gnita1Lecanicilliu。。。andincognttabyecantctllzumattenuatumanaCloningofChitinaseGeneLACHI1fromtheFungusThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyZhaoYang(CollegeofA

2、gronomyandPlantProtection)Supervisor：Prof．WuXiaQingdao，ChinaJune，2014万方数据独创性声明

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4、IIIIIIIIIIIIIIIIY2663294本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：谗

5、j军时间：出，乒年石月砂阳关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：趣墀时间：≥。肜年6月切日导师签名：时间：乒。／眵年6月w日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要渐狭蜡蚧菌对南方根结线虫卵孵化抑制及其几丁质酶基因LACHI1的克隆摘要根结线虫(Meloi

6、dogynespp．)病是世界范围内发生的一种重要植物寄生线虫病害。传统的化学杀线剂会对环境造成严重污染且对人畜有害，化学药剂的大量使用使植物寄生性线虫抗药性随之加强，降低其防治效果。利用天敌真菌进行防治是植物根结线虫病害可持续治理的理想途径之一。食线虫真菌是土壤中能够抑制植物寄生性线虫种群数量的重要微生物。本研究自黑龙江大豆孢囊线虫孢囊上分离到一株真菌CGMCC5328，通过形态学特征及ITS序列比较分析，鉴定该菌株为渐狭蜡蚧菌Lecanicilliumattenuatum，该茵具有产生几丁质酶特性。利用NAG法测定渐狭蜡蚧菌

7、CGMCC5328的几丁质降解酶系的活性在第4d达到酶活高峰，为16．90U／mL：利用pNP法测定其外切几丁质酶活性显示该茵在第6d达到酶活高峰，为O．59U／mL，直到第14d一直保持较高活性。活性电泳测定其几丁质酶分子量分别为79．6kDa、65．6kDa、54．1kDa、42．1kDa和32．9kDa。渐狭蜡蚧菌CGMCC5328不同浓度几丁质酶粗酶液处理南方根结线虫卵，其中第7d100％浓度的几丁质酶粗酶液对卵孵化抑制率最大．可达83．17％。该茵接种南方根结线虫卵第6d的寄生率为85．10％。克隆渐狭蜡蚧茵几丁质酶基

8、因，为进一步明确该茵产生的几丁质酶对定居性根结类和孢囊类线虫卵孵化抑制作用提供理论依据。通过简并引物设计和RACE技术，克隆得到渐狭蜡蚧菌中的几丁质酶基因，利用生物学软件分析该基因序列及其编码的氨基酸序列。本研究首次从渐狭蜡蚧茵中克隆得到一个几丁质酶基因LACHll，该基因DNA序列长1743bp，含3个内含子，包含1272bp开放阅读框，编码423个氨基酸，理论分子量45．9kD，等电点5．90。LACHll基因编码的几丁质酶，属于糖基水解酶18家族几丁质酶。同源性比对袁明该茵产生的几丁质酶与昆虫寄生真菌和食线虫真菌产生的几丁

9、质酶有很高的同源性。以上结果表明渐狭蜡蚧菌CGMCC5328具有高效产几丁质酶特性且能够寄生南方根结线虫卵，对南方根结线虫的生物防；台具有重大应用潜力。关键词：渐狭蜡蚧茵：南方根结线虫：寄生性：几丁质酶：克隆：系统发育分析万方数据Egg--hatchingSuppressionofMeloidogyne‘1LnicilliumattenuatumandincognitabyecantctlltUmattenaCloningofChitinaseGeneLACHI1fromtheFungus—AbstractRoot．knotne

10、matodes(Meloidogynespp．)havebeenreportedasoneofthemostimportantplantpathogens，whichthreatentheyieldsinChina．Chemicalnematicideshadc