氟暴露致体外培养pc12细胞损伤机理的研究

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1、硕士学位论文万方数据氟暴露致体外培养PC12细胞损伤机理的研究指导教师姓名、职称主±童查送单位地址逝鎏堙整盘堂垡堂鱼生金盘堂堂堕申请学位级别硕士论文提交时间2Q兰垒主垒旦论文答辩时间2Q曼垒生量旦学位授予单位和日期逝鎏堙基盘堂《2Q里垒生月2答辩委员会主席鲞箜空论文评阅人2013年5月21日万方数据DissertationforMasterStudyonDamageMechanismofCulturedPC12CellsExposedtoFluorosisAinZoologyUndertheSupervisionofProfessorZi-guiZhangByZhejiangNo

2、rmalUniversityJinhua，Zhejiang，ChinaMay，2014万方数据氟暴露致体外培养PCI2细胞损伤机理的研究摘要氟广泛分布于自然界，是一种人体必需的微量元素，但长期过量摄入，可在体内蓄积，引起地方性氟中毒，严重损害机体的骨相和非骨相器官。其损伤可能与氟引发的氧化应激有关，但具体机制仍不明了。细胞凋亡或许是其中的关键一环。近年来，内质网应激所引起的细胞凋亡，已经成为人们研究氟致机体损伤的热点。然而其侧重点多是关于内质网应激在氟致骨相器官损伤方面的研究，而在非骨相器官上研究较少，并且传统的氧化应激检测指标如SOD、MDA等，由于其测定方法受多种因素影响，不

3、仅特异性与敏感性均较低，且所得结果也互有差异或相互矛盾。本研究采用直接测定神经细胞内ROS浓度变化的方法，对进一步探讨氟致神经细胞损伤作用的分子机理有十分重要的意义。PCI2细胞来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，可在神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)诱导下增殖和分化为有交感神经元特性的细胞，广泛用于神经系统疾病的体外研究。本实验用不同浓度的氟(0．5、1．0、1．5和2．0mM)处理PCI2细胞，在不同的时间段(2、4、6、8、12、24和48h)用cck．8染色检测细胞活性；氟暴露2h后，用DCF标记检测细胞内活性氧的水平；氟暴露8h后，用Rhodamin

4、e123和JC．1染色检测细胞内线粒体膜电位的变化，用Hoechst．33342检测细胞凋亡状况；氟暴露24h后，用倒置显微镜观察细胞形态变化，应用westernblot方法检测凋亡相关蛋白PAI冲、P．elF和内质网应激相关蛋白XBP．1表达情况。实验结果如下：1．细胞活性检测结果：与对照组相比，染氟2h后，2．0mM组细胞存活率显著下降(尸<0．05)；染氟4h后，1．5和2．0mM组细胞存活率显著或极显著降低俨<0．05或P<0．01)；氟暴露8h及48h后，各组细胞存活率极显著降低衅0．01)；染氟12h后1．0和万方数据1．5mM组细胞存活率显著下降(尸<0．05)，2

5、．0mM组细胞存活率极显著降低(P

6、8h后，随着染氟浓度增加，Rho．123标记的细胞荧光强度基本呈增强趋势，显示细胞线粒体膜电位逐渐降低，与对照组相比，2．0mM组细胞线粒体膜电位极显著降低(P<0．01)；JC一1标记的细胞其荧光逐渐由红转绿，说明线粒体膜去极化逐渐加剧，即线粒体膜电位不断降低，表明细胞凋亡发生。5．细胞凋亡检测结果：正常细胞核为长圆形或卵圆形，细胞发生凋亡后，细胞核变圆，核固缩，染色加深，荧光强度增加。与对照组相比，各组荧光强度变化无显著差异(P>O．05)，除0．5mM组外，略有升高趋势，表明发生凋亡的细胞数量也略有增多。6．Westemblot分析结果：与对照组相比，1．0mM组XBP．1

7、和PARP蛋白表达水平均显著上升(尸0．05)。表明PARP可能是细胞凋亡的关键蛋白，XBP．1则可能是内质网应激介导细胞凋亡过程中的关键蛋白之结论：氟暴露可导致细胞活性降低，与染氟时间呈负相关性，与染氟剂量也基本上成负相关性；在一定的氟暴露时间段内，细胞内活性氧水平、细胞线粒体膜的损伤程度和细胞的凋亡水平基本与氟暴露水平成线性关系，提示氟暴露致