人源p--糖蛋白高表达mdr1--mdckⅱ细胞模型的建立及应用

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1、博士学位论文学校代码：10023学号：B2011008059人源P．糖蛋白高表达MDRl_MDCⅪI细胞模型的建立及应用EstablishmentandapplicationofMDRl-MDCKIIcellswithhighexpressionofhumanP—glycoprotein新型调血脂化合物IMM．H007的临床前药代动力学研究PreclinicalpharmacokineticstudiesofIMM-H007：anovellipidmetabolismregulator所院：姓名：指导教师：导师小组：学科专业：药物研究所李雪李燕研究员扈金萍、盛莉、李燕药理学研究方向：药

2、物代谢动力学完成日期：2014年4月DissertationofPh．D．￡垒i坠!!!垒!型!翌z21丛!垒堡!!墨呈熊翌望丝!!坐竖型翌i旦翌坚!尘!!!里旦!!!g!目录缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9第一章人源P．糖蛋白高表达MDRl_MDCKII细胞模型的建立及

3、应用⋯⋯⋯⋯．．16前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16第一节人源P．糖蛋白高表达MDRl_MDCKII细胞模型的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．181．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．182．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．193．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．303．1．P—gP表达质粒的酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．2．秋水仙碱筛选浓度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．3病毒包装细胞

4、MDRl-PA317的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．313．3．1病毒上清液中目的基因MDRI的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3l3．3．2病毒滴度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．323．4MDRl-MDCKII细胞模型的建立与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．4．1RT．PCR检测MDRl_MDCKII单克隆细胞株中mRNA的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．4．2Rh0123在MDRl-MDCKII细胞中的积聚⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．333．4．3Westernblot检测MDRl-MDCKII单克隆细胞株中P．gp的表达⋯⋯

5、⋯⋯⋯．333．4．4MDRl-MDCKII细胞模型中MDRl基因和蛋白表达量的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．4．5地高辛在MDRl-MDCKII细胞中的转运研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。353．4．5．1标准曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．353．4．5．2地高辛在MDRl-MDCKII细胞中的双向转运⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯354．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37第二节50种中药活性成分对P．糖蛋白和CYP3A4／5活性的影响及药物相互作用研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38

6、1．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一382．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．393．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一443．150种中药活性成分对MDRl-MDCKII细胞毒性的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．443．2中药活性成分对P．gp介导的地高辛转运活性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．2．1中药活性成分对MDRl-MDCKII细胞地高辛转运活性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．2．2中药活性成分对Caco．2细胞地高辛转运活性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．533．3中药活性成分对P

7、．gPATPase活性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54竺垫也!苎垒!!垒!巴Z旦!丝!壁!!!!兰!堡翌堡垒!!堂曼旦翌!竺翌丛!垒堡!!笪2111曼13．4中药活性成分对人肝微粒体CYP3A4／5活性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．563．5中药活性成分与P-gp和CYP3A4的分子对接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．573．5．1中药活性成分与P．gp的分子对接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯573．5．2中药活性成分与CYP3