番茄花粉生殖细胞与精细胞的分离纯化

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1、万方数据学校代码：10225学号：S14509学位论文番茄花粉生殖细胞与精细胞的分离纯化指导教师姓名：申请学位类别：论文提交日期：授予学位单位：鲁云龙戴绍军王台魏丽勤硕士教授东北林业大学研究员中国科学院植物研究所副研究员中国科学院植物研究所东北林业大学未夕厶专业领域：细胞生物学论文答辩日期：授予学位日期：答辩委员会主席：论文评阅人：栉素大学万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S14509煳燃Vo'石西爿“X‘翼DissertationfortheDegreeofMasterIsolat

2、ionandpurificationofgenerativeandspermcellsintomatoCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：DateofOralExamination：University：LuYunlongProf．DaiShaojunProf．WangTaiandA．EWeiLiqinMasterofScienceCellBiologyNortheastForestry万方数据摘要花粉(雄

3、配子体)的发育涉及精细的调控机制，我们希望能通过高通量的组学技术手段，在转录组、甲基组学等水平了解细胞分化前后的基因表达调控特征，以期进一步了解雄配子体发育过程中，细胞功能分化和细胞命运决定的分子机制。获得大量高纯度的生殖细胞和精细胞是首要前提，因此我们对大量分离生殖细胞和精细胞的试验进行了探索。我们以番茄花粉为实验材料，通过短时间(20分钟)体外萌发培养，使花粉管长度小于花粉粒直径，再利用渗透压冲击法释放出位于花粉营养细胞细胞质内的生殖细胞，并结合Pereoll密度梯度离心，对其进行大量分离纯化。又通过长时间(10小时)

4、的体外萌发培养，使生殖细胞在花粉管中完成分裂形成两个精细胞，再利用酶解法释放出花粉管中的精细胞并结合Percoll密度梯度离心，完成了精细胞的大量纯化。应用上述方法分离生殖细胞的产率约为2．8‰5．6％，细胞密度约为0．5×107～1×107个／mL，精细胞的产率约为3．7％～5．5％，细胞密度约为1．0x107～1．5x107个／mL，并且FDA染色结果显示，分离细胞的活性完好。我们还发现，萌发培养液中适宜的花粉密度是影响番茄花粉管生长状态的重要因素；不含无机离子和缓冲剂的渗透液更利于使释放出的细胞质维持弥散状态；同时，

5、在常温下进行分离可能更有利于保持番茄花粉生殖细胞的生活力。这是首次大量分离出具有细胞活性的番茄花粉生殖细胞和精细胞的案例，为接下来组学水平的研究提供了可靠的材料保证，进而为研究雄配子体发育过程以及细胞功能分化奠定了基础。关键词番茄：生殖细胞；精细胞；分离纯化万方数据AbstractTheprocessofmalegametophytedevelopmentisrelatedtofineregulation．Withthehelpofhighthroughputomictechnology,wewishtoleammorea

6、boutthefeatureofthecellsineachperiodofmalegametophytedevelopmentattranscriptomeandmethy70melevelinordertohaveadeeperknowledgeofthemolecularmechanismrelatedtocellidentityandcelldifferentiation．Butthefirstandthemostimportantstepisgettinglargenumbersofhighlypurifiedg

7、enerativecellsandspermcells．Forthispurpose，wedidsomeresearchtoisolategenerativecellsandspermcellsinlargescale．Wechosetomatopollenastheexperimentalmaterial．Aftergerminationcultivating／nvitrofor20minwhengerminatedpollengrainshadapollentubeshorterthanthediameterofthe

8、pollengrain，wesuccessfullyreleasedgenerativecellsbyosmoticshock。Andthen，wemadethempurifiedbyPercolldensitygradientcentrifugation．Onanotherhand，throughge