两种虹彩病毒的转录组及部分基因功能研究

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1、中山大学博士学位论文两种虹彩病毒的转录组及部分基因功能研究姓名：谢俊锋申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：何建国20060601摘蟹两种虹彩病毒的转录组及部分基因功能研究专业：水生生物学博士生：谢俊锋指导教师：何建国教授中文摘要虹彩病毒是水生经济动物的主要病原，对水产养殖业造成了严重的经济损失，对其转录情况和基因功能的研究尤为必要。本论文根据两种虹彩病毒：蛙病毒属的虎纹蛙病毒(TFV)和肿大细胞病毒属代表种传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的全基因组序列，设计和制作了基于寡聚核苷酸的TFV基因芯片和ISKNV基因芯片。检测了不同感染时间段两种病毒基因的转录情况，验证了两种病毒的各个预测

2、的ORF的真实性，并利用多种聚类分析方法将转录的ORF划分为极早期(IE)ORF、滞早期(DE)ORF和晚期(L)ORF。对部分ORF在病毒增殖过程中的表达模式和预计的作用进行了阐述，较为全面的说明了TFV和ISKNV增殖过程中的转录情况。根据ISKNV基因芯片的结果，对ISKNV转录的检测不但确定了其ORF的表达协调性，而且比较了宿主基因在病毒增殖过程中的表达情况。本论文对两种虹彩病毒转录组基因芯片的制作和检测，为深入研究它们的基因功能打下基础。在细胞水平上，利用报告基因lacZ建立了以小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)为基础的RNA干扰(RNAint

3、erference，RNAi)体系，比较了不同RNAi策略包括体外转录siRNA和体内表达的shRNA(smallhairpinsiRNA，shRNA)在鱼类细胞中对报告基因的沉默作用，发现体外转录的siRNA效果更好。根据TFV基因芯片实验的分析，选择了TFV的主衣壳蛋白ORF096(majorcapsidprotein，MCP)作为靶基因，将体外RNAi系统成功地应用到抑制中山火学博：L学位论文澍俊锋TFV的增殖上，更广泛的比较了不同RNAi策略包括化学合成siRNA、体外转录siRNA、体外转录长链双链RNA(mega—longdoublestrandedRNA，MEGA-dsRNA)

4、和体内表达的shRNA对TFV的抑制作用，最后选定体外转录的siRNA作为最有效的实验手段。从细胞病理变化、半定量RT-PCR、病毒滴度以及观察细胞内病毒粒子变化的电子显微镜方法等对siRNA抑制TFV增殖的效果进行了检测，证实siRNA不但在感染早期特异地减少了TFVmcp的RNA水平，还在感染晚期显著地抑制了TFV的增殖。本沦文首次在虹彩病毒领域成功地建立了RNAi体系并应用到抑制病毒增殖上。根据ISKNV基因：吝片的分析结果，选择了在其基因组中同类型ORF编码数量多、表达时相各异的一类基因——其蛋白产物含有环指(RINGfinger)结构域的环指蛋白基因进行了功能性的深入研究。利用体外

5、泛素化系统，证明了ISKNV编码的5个环指蛋白中的4个病毒蛋白(viralprotein，VP)(VP012、VP065、VP066和VPl11)具有泛素连接酶(E3)的活性。经点突变的环指序列突变体失去了E3活性，证明了E3活性对环指区域氨基酸序列的依赖性。改变反应体系中的锌离子浓度对ISKNV环指蛋白的E3活性有影响，证明锌离子对环指蛋白的必要性和催化性。通过酵母双杂交系统，筛选出与VP099相互作用的宿主蛋白(hostprotein，HP)CathepsinB，并用免疫共沉淀验证了两者的相互作用。本论文首次证实了虹彩病毒中编码具有功能的环指蛋白，并找到了与环指蛋白相互作用的宿主蛋白，为

6、研究病毒侵染过程中的信号传导途径打下基础。关键词：虹彩病毒，TFV，ISKNV指蛋白，体外泛素化反应，酵母双杂交，基因芯片，转录组，RNAi，siRNA，环蛋白相互作用Transcriptomeandsomegenes，functionalstudiesontwotypesofiridovirusesMajor：AquaticBiologyName：XieJunfengSupervisor：ProfessorHeJianguo，Ph．D．AbstractIridovirusisthemajorcausativepathogenoneconomicanimalsinaquaculture．It

7、isnecessarytoinvestigatethetranscriptomeandgenefunctionofthem．Todefinethetranscriptionalprogramsoftwoiridoviruses，TFVbelongingtoRanavirusandISKNVwhichisthetypespeciesofMegalocytivirus，twotypesofcustomoligon