血型b抗原模拟多肽fas重组腺病毒对小鼠4t1乳腺癌影响的实验研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文血型B抗原模拟多肽／Fas重组腺病毒对小鼠4TI乳腺癌影响的实验研究TheinfluenceofrecombinantadenovirusexpressingBloodgroupBmimicpolypeptides／Fasonmouse4T1breastcancer课题来源：导师指定专业名学位申请指导教称肿瘤学人姜兆静师张积仁教授答辩委员会主席答辩委员会成员陈尊器教授夏建川教授张为民教授黄宗海教授汪森明教授论文评阅人葛曰萍教授曹漫明副教授答辩秘书丁为民副教授2012年5月25日rllllllll／lllfllll

2、llllllll／lllllllllllllllllllllllY2257037血型B抗原模拟多肽／Fas重组腺病毒对小鼠4T1乳腺癌影响的实验研究硕士研究生姜兆静指导教师张积仁摘要研究背景机体的免疫系统具有控制肿瘤发生发展的能力，是肿瘤研究中最古老的概念之一。其中肿瘤微环境的免疫状态在肿瘤发生学及治疗方面又具有至关重要的作用。随着科学技术和方法学的进步，越来越多的肿瘤抗原被鉴定出来。研究者发现，虽然很多肿瘤抗原的免疫原性不弱，而且抗原提呈细胞可迅速呈递大多数肿瘤抗原，肿瘤患者体内也确实存在针对肿瘤抗原所产生的免疫应答，但相关免疫应答产物并不能产

3、生有效的抗肿瘤效应。当前多数免疫治疗方法均能够增强患者全身的免疫功能，但抗瘤效果却与预期的相差很多。原因主要在于肿瘤患者免疫功能状态并不能直接反应机体的抗肿瘤免疫效应，即使患者全身免疫功能得到改善，肿瘤微环境内的免疫效应却仍处于抑制状态。肿瘤微环境是肿瘤细胞发生发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所，肿瘤微环境内存在多种因素均与局部免疫抑制状态的产生有关，并形成TIJ中瘤局部微环境中特有免疫模式。肿瘤细胞不仅逃避免疫系统的攻击，同时也抑制其生

4、长环境中的免疫细胞的正常功能。这些因素为开辟新的肿瘤免疫治疗方案提供了思路。随着分子生物医学的发展，免疫治疗作为肿瘤第四种治疗模式．生物治疗的重要组成部分，在肿瘤治疗中的地位和作用日趋重要。逆转肿瘤微环境的免疫摘要抑制状态是当前肿瘤免疫治疗的难题与突破点。研究目的应用健康成人B型血全血腹腔注射免疫BALB／c小鼠使其体内产生抗血型抗原B抗体；构建BALB／c小鼠4T1乳腺痛荷瘤模型；在BALB／c小鼠荷瘤模型中瘤内注射血型B抗原模拟多肽／Fas重组腺病毒，测定其在肿瘤组织中的表达情况，观察其对人红细胞悬液免疫后的小鼠肿瘤生长的抑制作用及对生存期的

5、影响；测定瘤内注射重组病毒后小鼠肿瘤微环境淋巴细胞、TNF．a、IFN吖、IL．2、微血管密度等免疫功能指标，判定其对肿瘤微环境免疫抑制状态的逆转作用。实验方法1将健康成人全血稀释成不同浓度红细胞悬液，腹腔注射免疫BALB／c小鼠，每次0．2ml，2次／周，免疫后3天、7天、14天、21天、28天，分别测定小鼠体内产生抗血型抗原B抗体效价，择优选择最适宜的红细胞悬液免疫浓度，分析抗体产生的趋势，为后续试验做准备；2无菌环境下培养4TI-孚L腺癌细胞，至对数生长期，制备细胞悬液(浓度为106／m1)，小鼠乳腺脂肪垫区皮下注射上述浓度4T1乳腺癌细胞

6、0．2ml。7天左右，肿瘤长至lcmT左右大小，选取肿瘤无出血坏死的小鼠进一步实验；3选取肿瘤大小相近、肿瘤无出血坏死的18只荷瘤小鼠，随机分3组，分别瘤内注射重组腺病毒Ad．Pl／Fas(效价为7x1010pfu／mL)、空腺病毒(效价为2．21x1011pfu／mL)、0．9％NaCL0．1ml，连续注射3天。注射后第10天处死三组小鼠，取出肿瘤组织，应用westernblot方法测定B／Fas在肿瘤组织中的表达情况。流式细胞仪检查肿瘤内淋巴细胞的变化、ELISA法测定TNF．a、IFN吖、IL．2含量、免疫组织化学法检测CD34表达，并判定

7、其对肿瘤微环境免疫抑制状态的逆转作用；436只荷瘤小鼠，分三组，每组12只，每组随机取5只小鼠应用游标卡尺测量三组小鼠肿瘤长径a和垂直宽径b，比较注射前、注射后3天、7天、14天三组硕士学位论文小鼠肿瘤体积变化，并观察所有荷瘤小鼠的生存期，设定观察期限为60天。肿瘤体积计算方法如下：V(cm3)=1／2axb2。观察不同处理对小鼠肿瘤生长的抑制作用及对生存期的影响。5统计方法(1)计量资料结果以均数士标准差表示；(2)不同分组不同时间抗血型抗原B抗体效价、目的蛋白B／Fas的表达量灰度值、肿瘤体积比较应用SPSS13．0统计软件包采用重复测量数据

8、的方差分析比较，不同时间点各处理组间抗血型抗原B抗体效价、目的蛋白B／Fas的表达量灰度值、肿瘤体积、肿瘤内淋巴细胞亚群、细胞因子的测定