基于sage数据库挖掘技术筛选分析前列腺癌相关新基因

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1、第三军医大学博士学位论文基于SAGE数据库挖掘技术筛选分析前列腺癌相关新基因姓名：吴刚申请学位级别：博士专业：外科学（泌尿外）指导教师：靳风烁20061101第三军医大学博士学位论文基于SAGE数据库挖掘技术筛选分析前列腺癌相关新基因z摘要前言：随着人类基因组计划的初步完成，人们迎来了以转录组学和蛋白质组学为核心内容的后基因组(功能基因组、)时代。研究人类基因功能最后注解基因以揭示生命活动机理是今后生物医学研究至为重要而艰巨的任务。通过研究肿瘤差异表达基因的功能来阐明肿瘤发生发展的分子机理也是肿瘤研究的重

2、要工作。前列腺癌为全世界特别是欧美国家男性常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一。我国随着人口老龄化、生活习惯的改变及医疗检测水平的提高，发病率逐年提高。筛选并研究前列腺癌与正常组织的差异表达基因，不仅可帮助阐明前列腺癌发生发展的分子机理，而且可为临床提供有价值的诊断指标及治疗的靶基因。基因表达高通量研究技术及生物信息学的发展，有力地推动了前列腺癌相关基因的研究。随着美国癌症基因组解剖计：圪fJ(CGAP)的实施，美国NCBI收录了大量来自不同的正常及肿瘤组织的基因表达系列分析(SAGE)数据库，分别通过CGA

3、P提供的免费在线分析软件就可以比较任意数据集组合之间的基因差异表达，进一步深入分析而得到相关肿瘤与正常组织的差异表达基因。这种“硅片实验”的分析结果都需要生物学实验验证，但它却可以给研究者大量的实验提示并减少实验工作。因此，用公众数据库分析发现新的前列腺癌相关基因，然后用生物医学方法证实，最后针对兴趣基因进行功能研究并解释与前列腺癌发生发展的关系。不仅能为功能基因组学的注释基因提供实验依据，而且可为发现前列腺癌新的诊断方法及治疗途径奠定重要的理论及实验基础。实验方法：通过选择合理的数据库及统计参数，利用N

4、CBI提供SAGE数据库及分析软件获得在前列腺癌组织相对正常组织差异表达超过5倍SAGE标签，然后进行标签筛选、标签对基因电子确认及GLGI确认，最后注释差异表达基因的主要功能及与前列腺癌的关系并确定进一步研究的兴趣基因。同样方法得到在男性全身脏器组织中优势表达于前列腺组织的一系列基因，并确定进一步研究的兴趣基因。针对在前列腺优势表达的新基因LOC389816，用RT-PCR在男性的主要脏器组织中验证其表达情况，同时用生物信息学方法对新基因LOC389816进行序列分析及功能预测。针对前列2本课题受国家自

5、然基金面上项目(30400446)资助6第三军医大学博士学位论文腺癌新的上调表达基因BRP44，NorthernBlot分析验证在前列腺腺瘤及癌组织标本的差异表达，同时用生物信息学方法对基因BRP44进行序列分析及功能预测；构建BRP44与GFP融和表达真核载体，转染高表达该基因的前列腺癌细胞株LNCaP，激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位；体外转录法合成BRP44的siRNAs，转染LNCaP细胞系降低BRP44的基因表达，观察LNCaP细胞在BRP44表达降低后细胞生长增殖曲线、细胞周期分布及分

6、泌PSA的量的变化以初步了解BRP44在LNCaP细胞中可能的功能。实验结果：1)得到代表前列腺癌差异表达基因的可靠SAGE标签55条，分别代表着28条上调表达和27条下调表达基因，其中23条基因未见文献报道与前列腺癌相关，可能为新的前列腺癌相关基因。确定功能完全未知的BRP44基因为进一步研究的兴趣基因。得到代表前列腺优势表达基因的可靠标签13条，其中9条已经有文献报道，另外4条有希望成为前列腺新的优势表达基因。确定功能完全未知的LOC389816为进一步研究的兴趣基因。用GLGI方法从30条不确定SA

7、GE标签中获得2条cDNA片段，可能为在前列腺癌中上调表达的序列未知新基因或者某基因新的剪接体。2)RT-PCR证实：在正常人的心、肝、结肠、肺、骨骼肌、睾丸、前列腺、皮肤、胃、肾脏、脾脏及胰腺共12种组织中，只在前列腺组织中检测到了LOC389816基因的表达。生物信息学分析提示，LOC389816表达的蛋白产物可能是一个具有信号传导活性的膜受体蛋白。3)NorthernBlot分析了10例前列腺癌组织，2个前列腺癌细胞系(pc．3及LNCaP)及8例前列腺腺瘤组织。结果证实BRP44在前列腺癌组织的表

8、达丰度高于良性前列腺腺瘤组织，BRP44在LNCaP细胞中高表达而在PC．3中不表达。生物信息学方法初步推断BRP44可能是一个在转录或者翻译水平控制肿瘤细胞线粒体某些基因的表达的调节因子。GFP．BRP44融和蛋白在LNCaP的细胞核及细胞浆均有表达，在胞浆的表达相比胞核更强。BRP44．siRNAs转染LNCaP细胞24h后可以降解BRP44mRNA近60％，转染48h后LNCaP细胞生长增殖加快，同时S期细胞显著增加，而