trpm7通道在耳蜗的表达定位及功能研究

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1、隶。初大·粤博士学位论文万方数据TRPM7通道在耳蜗的表达定位及功能研究本论文获国家自然科学基金面上项目(30770537)资助万方数据EXPRESSION，LOCATIONANDFUNCTIONOFTRPM7CHANNELINMOUSECOCHLEAADissertationSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofDoctorofScienceBYSHIli-juanSupervisedbySHENZhi-junInstituteofLifeSciencesSoutheastUn

2、iversityMay2014lIIIIIIIIlUMIIlUIIlY2707963万方数据东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：歪函婚日期：趁略鲴螳东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送

3、交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括以电子信息形式刊登)论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布(包括以电子信息形式刊登)授权东南大学研究生院办理。研究生签名：着瓣导师签名：显』芝日期：z。晔．石．厂万方数据中文摘要TRPM7通道在耳蜗的表达定位及功能研究研究生：石丽娟导师：沈之君教授离子通道与疾病课题组东南大学“发育与疾病相关基因”教育部重点实验室，东南大学生命科学研究院，江苏省南京市四牌楼2号

4、，210096研究背景和目的：由噪声、药物、遗传、感染、老龄化及全身性疾病导致的听力损害严重影响着人们的生活质量和人际交流，费用高昂的耳蜗移植和安装助听器只能部分的恢复听力，并且给个人和社会带来巨大的医疗负担，因此听力保护是当今社会面临的重要问题。大量实验结果显示，听觉功能与多种基因调控的离子通道功能密切相关。对小鼠耳蜗发育过程中瞬时受体电位(transientreceptorpotential，TRP)基因定量分析发现Trpm7基因在耳蜗具有较高的表达，但该通道在耳蜗的定位及其功能研究尚未见报道。TRPM7通道广泛表达于哺乳动物的多种组织器官

5、，与胚胎发育、细胞生存和增殖、神经递质释放以及神经细胞的死亡都有着密切的关系，成为近年来离子通道领域研究的热点。本实验旨在研究：1．TRPM7通道在小鼠出生后耳蜗发育的不同时期、不同部位表达水平和定位的研究；2．TRPM7通道在螺旋神经节神经元(Spiralganglionneuron，SGN)细胞上的作用研究：3．模拟噪声后SGN形态和存活状态的变化与TRPM7通道功能的关系。研究结果将有利于全面的认识TRPM7通道在耳蜗中的细胞分布和出生后耳蜗发育过程中的变化以及对SG细胞功能及存活的影响，为临床保护和恢复耳蜗功能提供新的实验依据。研究内容

6、和方法：1．以出生后不同发育时期(P0、P7、P15、P21)d、鼠的耳蜗为研究对象，通过分子生物学方法和免疫组织化学技术确定Trpm7基因和蛋白在耳蜗的表达变化以及该通道的组织分布情况；2．以培养的原代SGN细胞为研究对象，利用TRPM7通道阻断剂2-APB，观察TRPM7通道对SGN生理作用，并观察TRPM7通道是否会通过介导ca2+超载引起SGN的损伤，将揭示TRPM7通道介导的Ca2+超载与SGN的损伤的关系：3．通过培养基中加入过量谷氨酸，模拟噪声引起的毛细胞过度兴奋，观察SGN损伤的程度和细胞的死亡率，探讨噪声导致的SGN损伤与TR

7、PM7通道功能的关系。结果：1．Trpm7mRNA和蛋白在P0表达水平最高，明显高于出生后其它时间点(西0．05)，之后，表达水平保持相对稳定状态；TRPM7通道主要表达于耳蜗毛细胞(HC)、血管纹(sv)和螺旋神经节(SG)三个部位；荧光灰度值分析结果显示，TRPM7通道在HC内的表T万方数据查蜜奎兰堕土兰垡堡壅达在P0最高，SV内的表达在P15最高，而SG内的表达在P21最高。2．急性分离培养的原代SG细胞中，SGN达到85％以上。分离后的SGN可以连续培养7天左右而保持良好的状态，这为我们的实验提供了充裕的时间窗口。利用Indo．1检测细

8、胞内ca2+浓度，低浓度Ca2+(0．3mM)培养基处理后，SGN内游离Ca：+浓度明显高于对照组(∥O．01)，给予TRPM7通道阻断剂2-APB预