中国人群非综合征性耳聋高频突变位点的快速荧光筛查

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1、博士学位论文论文题目中国人群非综合征性耳聋高频突变位点的快速荧光筛查研究生姓名吴子侠指导教师姓名秦正红梁中琴专业名称药理学研究方向分子诊断论文提交日期2013年3月中国人群非综合征性耳聋高频突变位点的快速荧光筛查中文摘要中国人群非综合征性耳聋高频突变位点的快速荧光筛查中文摘要目的：先天性非综合征性耳聋与人自身染色体上某些特定位点的变异相关。目前的检测手段不是比较昂贵就是操作繁琐容易出错，而且能够同时检测的突变位点非常有限。本课题研究的目的在于开发一种可以同时检测大部分相关突变位点的具有快速、价廉、操作方便等特点的实时荧光PCR检测方法。运用本项技术开发的先天非综合征性耳聋相关突变位点检测方法

2、不仅可以检测病人的突变位点，更重要的是可以在婚前，产前预防性筛查相关突变位点携带者，对提高人口素质，提高家庭生活质量有着重大意义。方法：查阅国内外相关文献，找出与中国人群先天性非综合征性耳聋相关的突变位点，根据NCBIGene数据库中所列出的基因序列设计引物从CDNA文库克隆含目的突变位点的DNA片段，回收目的片段并连接入目标载体。设计突变引物，利用定点突变方法得到含有突变位点的重组质粒。利用建立起来的防污染仿基因组PCR反应体系以重组质粒为模板筛选针对突变型等位基因的等位基因特异性引物。设计针对每个突变位点的分子信标和内参信标，利用之前得到的等位基因特异性引物，优化筛选出检测突变型基因的多

3、重实时荧光PCR反应条件。收集目标人群DNA样本，验证整个筛查体系的可行性和准确性。结果：经文献查找发现与中国人群先天性非综合征性耳聋相关的热点突变位点共有32个，实验克隆出了含目的突变位点的DNA片段，并且利用定点突变技术突变相应的基因序列，构建出含有目的基因片段的野生型重组质粒和突变型重组质粒；利用含鲑鱼精DNA的仿基因组体系和含有dUTP，尿嘧啶糖苷酶（UNG酶）的防污染体系筛选出针对各突变位点突变型等位基因的等位基因特异性引物；筛选出了针对各突变位点的分子信标并建立起了检测突变型等位基因的多重实时荧光PCR体系；利用已得到的筛查体系筛查收集到的73例样本，检测已建立的筛查体系的准确性

4、，突变携带者的检出率为100%。结论：实验所建立的先天性耳聋相关突变位点荧光筛选方法能够快速、准确、稳I中文摘要中国人群非综合征性耳聋高频突变位点的快速荧光筛查定的筛选出突变型等位基因携带者。关键词：实时荧光PCR；分子信标；非综合征性耳聋作者：吴子侠指导老师：秦正红教授梁中琴教授王进副教授II中国人群非综合征性耳聋高频突变位点的快速荧光筛查英文摘要MutationDetectionUsingReal-TimeQuantitativePolymeraseChainReactionwithMolecularBeaconforChineseInheriteddeafnessScreeningAb

5、stractAim:ThisstudywascarriedouttoestablishanewmethodwhichcombinesmolecularbeaconandReal-timePCRtoscreendeafnesscarrierstatusof32mutationswhichfrequentlyfoundinChineseinheriteddeafnessgroups.Thisnewmethodismuchcheaper,fasterandeasier.Onehand,thisnewmethodcouldscreenthe32mutationsforinheriteddeafnes

6、spatients,ontheotherhand,thisnewmethodcouldpreventinheriteddeafnesstohappen.Ithasanimportantmeaningtotakethisdetectionbeforemarriageandantepartum.Method:FirstwefoundthemutationswhichfrequentlyfoundinChineseinheriteddeafnessgroupsfrompapers.DownloadedtheDNAsequencesfromNCBI,andthenwedesignedtheprime

7、rsagainstthem.TheDNAsequenceswerecloneintoPMD18vector,thenwegotthemutationvectorsusesite-specificmutagenesis.Afterthatwescreentheallele-specificprimersusingwild-typeandmutant-typevectors.Thenwedesigneddetec