基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究

《基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码：10255学号：2110453东华大学硕士学位论文基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究STUDYONMONITORINGMETHODINTHEPREDICTl0N0FMICROCYSTINSBASED0NFLUORESCENTQUANTITATIVETECHNIQUE作者姓名：张容指导教师：张兴群学科专业：生物化工答辩日期：如mf、6基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究东华大学学位论文原创性声明愀本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究

2、工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：F-瞎日期：加(弓年f≯月逸日基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究东华大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解东华大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行

3、检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于，不保密可学位论文作者签名：张岩Et期：加B年f≥月万El雾季乏荸m—u翱r一”基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究摘要日趋严重的水体富营养化导致的水华现象己成为全球性的环境问题。水华形成的主要原因是由于水体中藻类的过度繁殖，其中的产毒蓝藻产生的蓝藻毒素蓄积在水中，严重威胁人们的饮水安全。蓝藻毒素是由七个氨基酸组成的环肽类物质，一般称为微囊藻毒素(Microcystins，MCYST)。微囊藻毒素通常以肝脏

4、为靶器官，具有很强的致癌作用，人类和动物长期饮用含有微囊藻毒素的水可引起中毒及肝损伤，严重者甚至死亡。因此，加强对水体中藻毒素的监控和检测十分重要。常用的微囊藻毒素检测方法有HPLC、LC—MS、GC—MS、ELISA、PPIA、TLC等，这些方法各有优缺点，但其共同的不足之处在于均无法支撑微囊藻毒素预警性检测体系的建立。微囊藻毒素是伴随着微囊藻的生长繁殖而产生的，其在水体中必然会有释放与蓄积的规律。利用现代生物技术手段，结合分子生物学方法，利用藻类细胞生长过程中相关基因丰度变化与微囊藻毒素产生与积累之间的关联性，实现毒

5、素的预警和预测对于保证饮水安全将是十分必要的。微囊藻毒素合成酶基因簇由(mcyA--C)和(mcyD_J)两个相邻的但转录方向相反的大操纵子构成，分别编码聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)和非核糖体肽合成酶(non-ribosomal基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究peptidesynthetase，Ⅻ心S)，凡能产生微囊藻毒素的藻株均含有藻毒素合成酶基因簇。本课题对微囊藻毒素合成酶基因的检测方法进行了研究，为水华发生和微囊藻毒素的积累进行预警性监测提供了理论支撑。首先，以微囊藻藻细胞

6、为对象，建立全细胞PCR检测方法。以微囊藻毒素合成酶基因为靶基因，设计特异性引物，建立不受其它藻类细胞或杂菌等外界环境因子干扰的藻毒素合成酶基因全细胞PCR检测体系。方法具有操作简单快速，成本低，稳定性好，特异性强的特点。在20ul反应体系中，以5ul预处理的藻细胞为模板，检测下限可达103cells／ml，适用于低藻浓度水样中微囊藻产毒基因的检测。其次，为了对微囊藻产毒基因进行定量，建立了针对微囊藻毒素合成酶基因的荧光定量PCR检测体系。以微囊藻毒素合成酶基因——-瑚cyA、meyB、mcyD、mcyH及微囊藻特异性t

7、6SrDNA部分核苷酸保守序列为靶基因设计合成特异性引物，SYBRGreenI为荧光染料，构建SYBRGreenI荧光染料实时定量PCR微囊藻毒素检测体系。构建两个藻种株的人工体系，分别制备五个含产微囊藻毒素基因的重组质粒标准品，选取103--108ng／ul六个稀释度，每次反应均设置阴性对照和三个重复，以确保实验数据有效。结果表明：每个稀释度的Ct值稳定，标准差和变异系数较小，所获标准曲线初始模板拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系良好，相关系数均在O．996以上，说明实验建立的标准曲线符合要求。最后，将以上构建的微囊藻

8、毒素实时荧光定量PCR体系法用于O基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究实验室培养的已知藻株及上海淀山湖水样的检测，并以高效液相色谱法(HPLC)进行验证对比，结果一致。研究结果初步说明，本课题建立的监测方法准确度高，灵敏度高，抗干扰性强。对于水样中产毒微囊藻的检测具有一定实用价值。关键词：MCYST；毒素合