泰安地区慢性感染hbv rt区耐药性分子变异及其体外表达

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1、泰山医学院硕士学位论文泰安地区慢性感染HBVRT区耐药性分子变异及其体外表达姓名：高鹏申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：王玉；于爱莲2012-02泰安地区慢性感染咖VRT区耐药性分子变异及其体外表达研究生：高鹏专业：病原生物学导师：王玉副教授于爱莲教授中文摘要目的本课题通过对临诊乙型肝炎病毒(HepatisisBVims，HBV)感染阳性患者所携带HBV基因组DNA(GenomicDNA，gDNA)的反转录酶(ReverseTranscriptaSe，RT)区进行调查，以期发现单个或多个有义变异位点，从而推断其变异与抗HBV药物的相关性，为发现HBV新的耐药位点及临床抗HBV用药提供

2、新的素材和理论参考；选取典型变异样本的HBVgDNA，构建其RT活性区的重组克隆，转染细胞并经间接免疫荧光(indirectimmullonuorescenceassay，IFA)检测其表达活性，为构建其永久表达细胞系做准备，同时为研究HBV变异与耐药性奠定基础。方法1．临床标本收集选取从2011年4月至2011年12月在泰安八十八医院用核苷(酸)类药物治疗的慢性乙型肝炎(ChronichepatitisB，CHB)大三阳患者，取其全血并分离血清，．80℃标记冻存。2．c肿大三阳血清中邸VgDNA的提取采用BIOMIGA公司血液基因组DNA提取试剂盒从保存的血清中分离、纯化HBVgDNA。3．

3、HBV全长gDNA的扩增取经PCR扩增HBvS基因片段为阳性的核酸样本，用互为重叠的两对引物经PCR分两段扩增HBVDNA全长基因(分为fl、亿两部分)。4．HBVgDNA的克隆和测序将扩增出的f1、岔片段PCR产物分别与原核载体pMDl8Tvecter连接，分别命名为T．n、T—f2，在固体培养皿上长出的优势抗性菌落，经初步特异性检测为阳性的克隆菌落后测序，并对测序结果进行拼接，比对，校正，分析HBV基因核苷酸差异、变异类型。5．重组质粒pc．I玎的构建选取一例HBVRT区发生经典变异的样本，并以该样本T．n、T．f2为模板，设计含有EcoRI和B锄HI酶切位点的引物，扩增回收RT片段，与克

4、隆载体pMDl8TsiInplevecter连接，测序验证后，将RT片段酶切回收，亚克隆入pcDNA3．1(．)中，构建真核表达重组质粒pc．RT。6．筛选cHO细胞对新霉素的敏感浓度用200u∥ml、400u∥ml、600u∥ml、700ug／ml、800ug／ml、1000u∥ml6个新霉素浓度梯度作用于CHO细胞，镜下观察选择出在10．14天内使细胞全部死亡的最低新霉素浓度。7．HBVRT区在CHO细胞中的瞬时表达将重组质粒pc．RT在阳性脂质体的介导下转染CHO细胞，6小时后加入带有新霉素筛选浓度的培养液，24小时后检测RT区在CHO细胞中的表达。8．IFA及westernblot检测

5、表达情况对转染的细胞用大三阳阳性血清介导的IFA和Westemblot检测HBVIⅡ区蛋白的表达。结果1．HBvDNA基因全长的测序比对在P区基因的反转录酶区，有几处需关注的变异情况(两例及以上出现的变异)，可能为引起CHB患者耐药变异的位点。2．CHO细胞对新霉素敏感浓度的确定经浓度梯度递倍稀释等筛选，最后确定CHO细胞对新霉素的最佳筛选浓度为700ug／ml。3．IFA实验及westemblot实验检测HBVIH区表达结果IFA实验结果显示，在荧光显微镜下，阳性表达细胞在70％以上。westemBlot实验结果显示，HBvRT区蛋白在CHO细胞中成功表达。结论1．上述慢性乙型肝炎患者应用核

6、苷(酸)类药物治疗过程中，P区出现几处需关注的变异情况，有5例样本与已报道的HBVRT区经典变异位点相同，有6处氨基酸变异与已证实的位点有所不同，初步发现了与HBV耐药有关新的潜在变异位点。2．成功将HBVRT区亚克隆入pcDNA3．1(．)，构建了真核表达重组质粒pc—RT。3．HBVI盯区真核细胞中成功表达，为构建该HBVRT区段永久表达性细胞系及进一步研究其分子机制和筛选新的治疗药物奠定实验基础。关键词HBVRT区，克隆测序，耐药性变异，表达，细胞系MOLECULARRESISTENSEVIRATIONANDVITROEXPRESSIONOFHBVRTFREGMENTORIGIRATED

7、FROMCHRONICHBVINFECTEDPATIENTSPostgraduate：GaopengMajor：Tutor：PathogenicBiologyViceprofessorWangYuProfessorYuAilianABSTRACTobjectiVeThisissuet11roughtheinfectionofhepatitisBVirus-positiVepatientscaITi