嗜酸氧化亚铁硫杆菌液氮保藏及分子多态性研究

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1、万方数据中图分类号Q窆三窆：窆2UDC579硕士学位论文学校代码密级10533嗜酸氧化亚铁硫杆菌液氮保藏及分子多态性研究LiquidnitrogenpreservationandstudyofmolecularpolymorphismsofAcidithiobacillusferrooxidansstrains作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：刘莉莉生物学微生物学资源加工与生物工程学院吴学玲副教授答辩委员会主中南大学2014年5月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师

2、指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特另tlDn以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：日期：立业年上月卫日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论

3、文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。嚣一Et日期：地年1月上导师签名：逊导师签名：益至型兰日期：碰f生年—芝月』L日万方数据硕士学位论文摘要嗜酸氧化亚铁硫杆菌液氮保藏及分子多态性研究摘要：嗜酸氧化亚铁硫杆菌(4．ferrooxidans)是微生物冶金的重要菌种，获得优良性状的菌株后，菌种的保藏是非常重要的。研究表明，嗜酸氧化亚铁硫杆菌在生理生化及遗传方面存在多态性。研究它的生理生化特征和基因特征有助于菌

4、种保藏工作的进行，有利于菌种库数据的梳理，保藏菌种的基因信息。利用液氮冷冻保护剂聚乙二醇(PEG)分别作为四株A．ferrooxidans的保护剂进行液氮保护剂最佳分子量及最佳浓度的探索。实验选用的三种分子量的PEG(PEG2000，PEGl2000和PEG20000)中，最小分子量的保护剂表现出一定优势。经20％的PEG2000保藏后的菌种存活率最高、活性恢复所需时间也最短，因而它的保藏效果最好。将20％的PEG2000及30％的甘油作为A．ferrooxidans长期液氮保藏的冷冻保护剂。对其保存两个月，六个月及一

5、年后的存活率及铁氧化活性恢复的周期进行测定。随着保藏时间的延长，存活率降低，铁氧化活性恢复的周期延长，但是20％的PEG的保藏效果优于传统的液氮保护剂甘油，表现为活化周期较短，存活率较高。实验证明利用20％的PEG作为A．ferrooxidans的液氮冷冻保护剂，能取得良好的保藏效果。即经过较长期保藏后仍能获得较高的存活率，复苏后的菌种经过短期活化便能恢复活性。本实验研究了17株分离自不同环境中的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株之间的系统发育关系和它们的基因特性。一株氧化硫硫杆菌(A．thiooxidansA01)和三株喜温硫杆

6、菌(彳．caldusD．1，S一1，S．2)被作为同属不同种的外源菌株，用来进行系统发育树的构建及亲缘关系的分析。所有菌株的16SrRNA以及16S．23S间隔序列被扩增并测序。这些测序结果，以及一些从NCBI数据库里搜索到的相近序列，被用来构建完整的系统发育树。利用16SrRNA基因序列及16S一23S间隔序列构建的系统发育树将所有的菌株分为四个或五个大的类群。REP-PCRfrepetitiveelementPCR)和AP—PCR(arbitrarilyprimedPCR)DNA指纹图谱得到的聚类分析将21株菌分为

7、四个基因组，并且这个分组与系统发育分组相吻合。A．ferrooxidans在系统发育和基因分组上都表现为两个明显不同的类群。为了研究两个不同类群A．ferrooxidans在铁硫氧化机制是否存在异同点，四个与铁硫氧化密切相关的基因(rusA，rusB，iro和hip)被扩增万方数据硕士学位论文摘要并测序。七株A．ferrooxidans含有rusA基因，它编码铜蓝蛋白，一个在铁代谢呼吸链上起着重要作用的蛋白质。另外的十株A．ferrooxidans中，编码一个同源蛋白(RusB)的基因，被扩增出来，目前rusB的功能还

8、不清楚。hip和f阳在A．ferrooxidans中的存在情况基本与t'US相同。依据菌株氧化亚铁和单质硫的能力，所有的菌株分别被分为三个类群，依据铁硫氧化能力的分组与分子分组无明显相关性。上述实验结果表明A．ferrooxidans系统发育的不同与它们的基因多态性有一定关系，两种类群的A．ferrooxidans可能存在不同的铁