appl1改善肥胖相关的胰岛素抵抗和内皮功能紊乱的机制研究

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复旦大学博士学位论文APPL1改善肥胖相关的胰岛素抵抗和内皮功能紊乱的机制研究姓名：王熠申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：李益明2012-04-05 复旦大学博士学位论文中文摘要：目的：胰岛素不仅可以促进肌肉和脂肪组织摄取葡萄糖，还可以在内皮细胞中刺激产生血管舒张因子一氧化氮(NO)和血管收缩因子内皮素一1(ET一1)，因此具有同时调节内皮功能和维持血糖稳态的作用。衔接蛋白APPLl已被发现在骨骼肌细胞中增强胰岛素刺激的Akt磷酸化。并且其表达量降低与内皮功能紊乱相关。但是，APPLl对整体的生理作用还未详细阐明。方法：APPLl转基因小鼠和基因敲除小鼠分别给与标准饮食或高脂喂养诱导肥胖。分离直径小于100uM的肠系膜小动脉(阻力血管)利用血管张力测定仪检测血管反应性，胰岛素在血管内皮中的信号转导和内皮素．1的表达水平分别利用western-blot和实时定量PCR进行分析，并检测小鼠代谢指标及葡萄糖耐量试验。结果：在野生型小鼠肠系膜小动脉中，胰岛素引起血管舒张，并随着年龄的增长或高脂饮食后而减弱。相比之下，过表达APPLl选择性增强胰岛素诱导的标准饮食小鼠的离体肠系膜小动脉的血管舒张，并能逆转衰老或高脂喂养引起的内皮舒张减弱。在高脂诱导的野生型肥胖小鼠中，胰岛素通过激活MAPK通路，促进内皮素．1释放引起血管收缩。Westernblot结果显示野生型肥胖小鼠内皮细胞中，胰岛素刺激的AktS473，eNOSsll79磷酸化减弱，ERKThr202n'yr204磷酸化在基础状态下和胰岛素刺激下均显著增强。高脂喂养的APPLl转基因小鼠的内皮细胞中，上述信号转导分子的磷酸化和标准饮食的对照组相似。而在APPLl基因敲除的小鼠中，胰岛素则诱导血管受缩，内皮细胞中胰岛素刺激的Akts473，eNOSsll79磷酸化明显减弱，相反，ERKTm02／Tyr204磷酸化显著增强。细胞实验证实APPLl通过竞争性抑制TRB3增强胰岛素刺激的Akt磷酸化，同时通过改变Raf-1的磷酸化位点抑制ERKI／2活性。过表达APPLl可降低高脂喂养诱导的高血糖和高胰岛素血症，且能显著改善由高脂喂养诱导的糖耐量受损。结论：APPLl在调节胰岛素血管舒张和收缩中起到了关键性的作用，APPLl作为一个新发现的调节胰岛素信号通路平衡的信号分子，为治疗代谢和血管疾病提供理论依据以及可能的治疗靶点。关键词：胰岛素，APPLl，内皮功能紊乱，信号转导中图分类号：R58致谢：本课题受到上海市科委：10JCl40100230771024，11411951900，lIDJl400100，l 复旦大学博士学位论文10JCl401002，llPJl402000；国家自然科学基金：30771024，30900502，81070680；上海市卫生局：XYQ2011002；973项目：2011CB910201及985111．YFX0302的资助。英文摘要：Objectives：InsulinstimulatesbothnitricoxidefNO)-dependentvasodilationandendothelin一1(ET-1)-dependentvasoconstriction．However,thecellularmechanismsthatcontrolthedualvasculareffectsofinsulinremainunclear．Thisstudyaimedtoinvestigatetherolesofthemulti—domainadaptorproteinAPPL1inmodulatingvascularactionsofinsulininmiceandinendothelialcells．ResearchDesignandMethods：BothAPPLlknockoutmiceandtransgenicmiceweregeneratedtoevaluateitsphysiologicalrolesonvascularreactivityandinsulinsignalinginendothelialcells．Results：InsulinpotentlyinducedNO-dependentrelaxationsinmesentericarteriesof8-week-oldmice，whereasthiseffectofinsulinwasprogressivelyimpaired谢thageingorupondevelopmentofhighfatdiet-inducedobesity．TransgenicexpressionofAPPL1preventedageing—andobesity—inducedimpairmentininsulin-inducedvasodilation，andreversedobesity-inducedaugmentationininsulin-evokedET-1一dependentvasoconstriction．Bycontrast，geneticdisruptionofAPPL1shiftedtheeffectsofinsulinfromvasodilationtovasoconstriction．Atthemolecularlevel，insulin-elicitedactivationofAktandeNOSandproductionofNOwereenhancedinAPPLltransgenicmice，butwereabrogatedinAPPLlknockoutmice．Conversely,insulin-inducedERKl／2phosphorylationandET-1expressionWasaugmentedinAPPL1knockoutmice，butwasdiminishedinAPPL1transgenicmice．Inendothelialcells，APPL1potentiatedinsulin-stimulatedAktactivationbycompeting谢t11theAktinhibitorTribble-3，andsuppressedERKl／2signalingbyalteringthephosphorylationstatusofitsupstreamkinaseRaf-1．Furthermore，over-expressionofAPPL1couldimprovehighfatdietinducedhyperglycemiaandhyperinsulinemia．Conclusions：APPLlplaysakeyroleincoordinatingthevasodilatorandvasoconstrictoreffectsofinsulin，bymodulatingAkt—dependentNOproductionandERKl／2-mediatedET．1secretionintheendothelium．Keywords：insulin，APPL1，endothelialfunction，signalingpat2 复旦大学博士学位论文ChineseLibraryClassification：R58Acknowledgement：ThisprojectwassupportedbyShanghaiScienceandTechnologyCommitte10JCl40100230771024，11411951900，11DJl400100，10JCl401002，11PJl402000；NationalScienceFoundationCommitte30771024，30900502and81070680；ShanghaiMunicipalHealthBureauXYQ2011002；973project：2011CB910201；985Project985111-Y-FX0302．3 复旦大学博士学位论文缩写及中英文对照：AChacetylcholineAdipoRadiponectinrecptorAPPLlAUCBATBMIDNA乙酰胆碱脂联素受体adaptorpr。teinc。吡洳IiIlgPTBd。m血，PH衔接蛋白APPLldomainandLeucinezippermotif1Areaundercurve曲线下面积brownadiposetissuebodymassindexDeoxyribonucleicacidEDCFendotheliumderivedconstrtionfactorsEDI之FendotheliumderivedrelaxationfactorseNOSendothelialnitriteoxidesynthaseepiepididymalfatERKExtracellularsignal—regulatedkinasesET．1endothelin．1FOX01Forkheadbox01FSHFollicle—stimulatinghormoneGLUT4glucosetransporter4Grb2growthfactorbindingprotein2GSK-3Glycogensynthasel【inase3GTTglucosetolerancetestHeterheterozygousHFDhighfatdietHOⅣ【AHomeostasisModelAssessmentICAMIntercellularAdhesionMolecule1IRSinsulinreceptorsubstrateITTinsulintolerancetest4棕色脂肪体重指数脱氧核糖核酸内皮衍生的血管收缩因子内皮衍生的血管舒张因子内皮一氧化氮合酶附睾脂肪细胞外调节蛋白激酶内皮素．1叉头转录因子卵泡刺激素葡萄糖转运子4生长因子结合蛋白l糖原合酶激酶．3葡萄糖耐量试验杂合子高脂饮食稳态模型细胞内粘附因子胰岛素受体底物胰岛素耐量试验 复旦大学博士学位论文KOknockoutL··NAMENG-·nitro·-L·-argininemethylesterMAPKmitogenactivitedproteinkinasemRNAmessengerRNANOnitriteoxidePphosphoPAI·1PlasminogenActivatorInhibitor-1Phosphoinositide-dependentkinasePHPleckstrinhomologyP13KPKBPKCPTBRab5RafRasShcSNPSTDsubtTGTRB3UCP．1WTphosphatidylinositol3kinaseproteinkinaseBproteinkinaseCPhosphotyrosinebindingRapidActionBattalion5receptoraccessoryfactorrasgproteinSrchomology2domain-containingsodiumnitroprussidestandarddietsubcutaneousfattotaltransgenictribbles3uncouplingprotein-1wildtype基因敲除硝基左旋精氨酸甲脂丝裂原激活蛋白激酶信使RNA一氧化氮磷酸化纤溶酶原激活物抑制剂．1磷酸肌醇依赖性蛋白激酶普列克底物蛋白同源结构域磷酸肌醇3激酶蛋白激酶B蛋白激酶C磷酸化酪氨酸结合快速反应受体辅助因子g蛋白包含有Src同源结构域硝普钠标准饮食皮下脂肪总蛋白转基因假性激酶同源蛋白3解偶联蛋白．1野生型 复旦大学博士学位论文1．1胰岛素抵抗是联系肥胖，2型糖尿病和心血管疾病的重要枢纽。胰岛素抵抗是指效应器官或组织对胰岛素生理作用不敏感的一种病理生理现象，其与一系列代谢及心血管疾病密切相关，包括2型糖尿病，脂质代谢紊乱，高血压，冠心病，动脉粥样硬化等[1】。一个被广泛接受的概念是，胰岛素抵抗是一种与肥胖有关的，组织长期暴露于有毒代谢产物(例如糖毒性，脂毒性等)和慢性炎症【2】(如炎症细胞因子等)的直接后果。肥胖与体内脂肪蓄积过多有关，BMI是常用于评价肥胖的指标之一，根据WHO定义，BMI≥25为超重，≥30为肥胖，但基于亚洲人群的流行病学调查，综合了BMI，腰围，血压，血糖，血脂等相关数据进行汇总分析显示，轻微的BMI增加即可增加糖尿病及心血管疾病的发生封信，因此在亚洲人种中，女性BMI≥25，男性BMI≥27为即为肥胖[3】。除BMI之外，还有其它评价肥胖的指标，如腰围，体脂含量等。由于饮食结构改变及久坐的生活方式，肥胖的发病率急剧上升，根据流行病学调查显示，在中国，超过1．3亿的人群肥胖或超重(根据WHO定义)【4]，而且这一数据也在飞速增长。肥胖的流行更加重胰岛素抵抗及其相关疾病的发病率。1．2胰岛素信号转导通路胰岛素是由胰岛B细胞分泌的维持血糖稳态的激素【5，6】。胰岛素作用于外周效应组织，如肌肉和脂肪组织可刺激葡萄糖转运子4(GLuT4)膜转位，促进葡萄糖清除【7】，在肝脏组织中促进糖原合成和抑制糖异生，维持血糖稳态【8】。除了上述这些经典的胰岛素靶组织外，胰岛素还可以作用于大脑【9]参与食欲调节，作用于胰岛B细胞促进增生[10】以及作用于血管内皮细胞，促进血管扩张，易化葡萄糖运输【11】，等非经典靶组织来帮助共同完成对系统代谢的调节。在细胞分子水平，胰岛素通过与其细胞膜上的受体相互结合发挥它的生理作用[12，13】。胰岛素受体是由二硫键连接的两个胞外的a亚基和两个跨膜的b亚基组成的四聚体构成[14．16]。胰岛素与a亚基结合后，胰岛素受体构象发生改变，从而激活胞内b亚基的酪氨酸蛋白激酶结构域，发生自磷酸化，并激活下游信号级联发应。胰岛素有两条主要的信号通路，一条与调节代谢和抗调亡相关，胰岛素受体白磷酸化后，招募并激活胰岛素受体底物蛋白(insulinreceptorsubstrate，IRS)【17-19]，IRS进一步激活磷酸肌醇3激酶(P13K)【20]，从而产生三磷酸肌醇和磷酸肌醇依赖性蛋 复旦大学博士学位论文白激酶(PDK)的激活[21]，并依次磷酸化蛋白激酶B(PKB，又称为Akt)。丝苏氨酸蛋白激酶Akt，是信号转导通路网络中的关键节点(Node)[221。Akt被激活后，根据上游信号及细胞种类的不同，直接磷酸化下游不同激酶，产生多种生物效应。在骨骼肌和脂肪细胞中[23，24]，Akt和aPKC激活可促进葡萄糖转运子4(Glut4)的膜转位[25，26]，促进葡萄糖摄取【27】。在肝脏细胞中，Akt可调节糖原合酶激酶．3(Glycogensynthasekinase3，GSK．3)[28】，叉头转录因子1(Forkheadbox01，FOX01)[29】磷酸化促进糖原合成和抑制糖异生。在血管内皮细胞中，Akt可直接磷酸化一氧化氮合酶(endothelialnitriteoxidesynthase，eNOS)第1177位丝氨酸【30】，进而增加一氧化氮(nitriteoxide，NO)产生。体外实验证明在培养的细胞中将eNOS第1177位丝氨酸磷酸化位点突变，可阻断胰岛素刺激Akt依赖的NO产生[31]。另有动物实验研究表明，Akt敲除小鼠的内皮细胞中eNOS活性减低[32】。另一条主要的信号途径丝裂原蛋白激酶途径主要与促进增殖和分化相关。此信号途径的激活是由胰岛素受体激活后招募的Shc蛋白激活下游的Ras／Raf／MEK／ERK信号级联途径来实现的。磷酸化的She可以招募并磷酸化生长因子受体结合蛋白2(growthfactorbindingprotein2，Grb2)[331，Grb2与鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS相结合促使小G蛋白Ras由非活性的GDP结合状态转换成活化的GTP结合状态，从而激活丝苏氨酸特异性蛋白激酶Raf-1[34]，引起下游基因转录，蛋白质合成和细胞生长分化[35】。另外除了产生NO，胰岛素还可以通过ERKl／2MAPK途径介导内皮素．1(endothelin-1，ET-1)的产生和释放[36．38】，在小鼠离体阻力血管的实验中也发现，胰岛素可以促进ET-1介导的血管收缩，加入ERKl／2的阻滞剂可以逆转这一过程【39】。但胰岛素如何通过MAPK途径促进ET-1的转录和释放，具体的分子机制还并未完全阐明。7 复旦大学博士学位论文GIUCO$@&qGLUT4MyotubesPDK口墨BADFOX()一1eN0s6SK一3Anti-apoptosishepatocytes鹏燃eMEKP。E刚}P逊到'■■●■■■■■■■rET一1endotheliumMitogeniceffects图1．1胰岛素信号转导通路示意图1．3生理状态下胰岛素促进血管舒张功能易化骨骼肌对葡萄糖的摄取由胰岛素信号转导的分子机制可以看出，胰岛素刺激GLUT4膜转位促进葡萄糖清除，以及刺激NO产生介导血管舒张，均通过统一的P13K-Akt信号转导途径[401。这给了我们一个启示，胰岛素激活同一个信号途径，产生两种生物学效应，在体内有着怎样的相互作用呢?胰岛素调节代谢的作用，尤其是在骨骼肌中的作用，已经得到了广泛的研究。而胰岛素在内皮细胞的作用也被越来越多的研究所证实。在血管系统中，胰岛素通过刺激内皮细胞产生血管舒张因子和血管收缩因子调节循环稳态。介导血管舒张是胰岛素主要的生理作用之--[41]。血管舒张作用主要与胰岛素刺激内皮细胞产生NO有关[41]。与经典的钙离子依赖机制不同的是，胰岛素刺激的eNOS激活通过磷酸化的机带U[42．44]。在体实验中，胰岛素刺激血管舒张作用主要表现为两个阶段，毛细血管招募(capillaryrecruitment)和肢体血流(1imbbloodflow)增加。前期的报道存在有不一致的地方，在一些研究中，8～■霰聪。p泠．陌》婶咔吣v；，，一．w，一。_。、- 复旦大学博士学位论文通过进食，或葡萄糖负荷后，胰岛素水平随之增加，导致肢体血流增加，血管阻力降fk乇[45．48]，而在另一些研究中，则没有发现胰岛素的这一现象[49，50]。但在阳性的结果中，确实发现胰岛素在骨骼肌组织中有促进毛细管招募的作用。骨骼肌中的微血管单位，由一个单一的终端动脉联系一个毛细血管网，是骨骼肌血流控制的最小功能单位[51】。终端动脉的扩张可以产生最大的毛细血管网灌注，即毛细管招募[521。动物实验和人体实验均证实胰岛素可以通过毛细管招募调控微血管血流[53]。在大鼠组织中，胰岛素灌注在5—10分钟就开始增加微血管血流。在停止胰岛素输注后，这种效应还可以持续15．30分钟[54]。而预先用NOS阻断剂处理后，可以降低胰岛素刺激的微血管血流增力n[55】。对于静脉注射胰岛素是否在人体内增加肢体血流也存在一些争议[47，56—60]。一些研究认为静脉注射胰岛素可以增加肢体血流，而另一些研究则没有发现阳性报道。这些矛盾的实验结果可能与实验方法(如多普勒超声法测定肢体血流存在较大的实验误差)以及胰岛素可以同时刺激血管舒张因子NO和收缩因子ET-1的释放，在不同实验个体中，胰岛素敏感性状态不同有关。胰岛素介导血管舒张的功能对促进代谢起着关键的作用，葡萄糖被运送至骨骼肌等组织进行代谢需要组织中血流和毛细管灌注增加(图1．2)。在基础状态下，终末段毛细管处于关闭状态，但是在进食混合餐或糖负荷后，胰岛素水平增加，刺激毛细管招募和血流增加，从而易化葡萄糖和胰岛素向靶组织中运输[61]。基础状态下二：嚆蚓一蕊埝。1进餐／糖负荷后图1．2骨骼肌组织中胰岛素调节代谢及血管活性的双重作用●，●●9 复旦大学博士学位论文1．4病理状态下内皮功能紊乱和胰岛素抵抗的相互关系血管内皮细胞可以释放内皮衍生的舒张因子(endotheliumderivedrelaxationfactors，EDI江)和内皮衍生的收缩因子(endotheliumderivedeonstfictionfactors，EDCF),在生理条件下，两者的产生维持在平衡状态。而在病理条件下，EDRF产生减少或活性下降，EDCF产生增多，内皮依赖的收缩作用增强，舒张功能减弱，这种状态被称为内皮功能紊舌L[62】。内皮功能紊乱是心血管疾病的前期表现。许多心血管疾病的独立危险因素包括高血脂，高血压，糖尿病，肥胖等增加内皮功能紊乱的风险。与此同时，增加心血管疾病风险的危险因素也增加胰岛素抵抗的风险【63】。因此，内皮功能紊乱与胰岛素抵抗通常共同存在。研究显示，糖毒性，脂毒性，炎症细胞因子和氧化应激等这些共同的致病因素可能是造成两者共同存在的基础，不仅如此，内皮功能紊乱和胰岛素抵抗还存在相互促进的作用【64]。直接在体内测定NO产生来评价内皮功能是非常困难的。首先，NO在体内的半衰期很短(～5秒)，其次它的浓度也非常低(pM级)。因此，测定内皮产生NO依赖的血管舒张是常用来评价内皮功能的方法。常用的激动剂如乙酰胆碱，刺激内皮细胞产生NO。另外，非侵入性的研究方法，如多普勒超声等，可以监测激动剂引起的血流增加，但是精确度有限。其它还包括循环中炎症，氧化应激等的生物学标志物的升高，也能从侧面反应内皮功能【65]。评价胰岛素抵抗的常用方法包括直接测量胰岛素敏感性，(如高胰岛素正血糖钳夹术)，间接测量胰岛素敏感性，(如最小模型法，口服葡萄糖耐量试验)，以及替代指标，(如HOMA指数(HOMA．indexes)，QUICKI，Matsuda胰岛素敏感性指数等)[66】。这些评价方法各有优劣，其中以葡萄糖钳夹术最为准确，但是由于费时费力及技术复杂性，不适用于大型流行病学调查和临床研究，通常用HOMA指数来评价在流行病学研究中的胰岛素抵抗[67】。1．4．1内皮功能紊乱在胰岛索抵抗中的作用横断面的研究表明，内皮功能紊乱是糖尿病发病的独立预测因素【68]。在一项前瞻性研究(FraminghamOffspringStudy)中也证实，循环中内皮功能紊乱的标志物如PAI-1，vWF，ICAM-1水平增高是胰岛素抵抗，糖尿病的发病的独立危险因素【69】。同样，在另一个大型在绝经后妇女的病历对照研究中(Women’SHealthInitiativeObservationalStudy)也发现，循环中E—selectin，ICAM一1水平增高也增加2型糖尿病lO 复旦大学博士学位论文的患病风险[70】。这些研究均提示了内皮功能紊乱与胰岛素抵抗的因果关系。动物模型也证实了这一观点。eNOS基因敲除小鼠中同时存在胰岛素抵抗和高血压。胰岛素刺激的葡萄糖清除降低40％左右[71]。部分eNOS基因缺陷的杂合子(eNOS+／-)小鼠在正常饮食条件下表现为胰岛素敏感及正常血压，在给与高脂喂养后，也发展为胰岛素抵抗和高血压[72，73】。在细胞水平上，内皮产生NO等舒张因子产少，导致血管舒张功能减弱和毛细管灌注减少，葡萄糖清除率下降。胰岛素刺激ET．1产生也可以拮抗胰岛素促进代谢的作用[74】。但在正常生理条件下，胰岛素刺激的NO产生可以抑制ET．1的作用[75，76]，但在NO产生减少的情况下，ET．1活性增强。这些病理反应导致外周组织(如骨骼肌)对胰岛素的生理效应下降，胰岛素抵抗。1．4．2胰岛素抵抗在内皮功能紊乱中的作用在胰岛素抵抗的患者中，同时存在有胰岛素诱导的血管舒张功能减弱。胰岛素刺激的肢体血流减弱已在肥胖，2型糖尿病和多囊卵巢综合症(PCOS)患者中证实[77．79】。在细胞分子水平，选择性胰岛素抵抗是导致内皮功能紊乱和胰岛素敏感性下降的共同因素[80]。导致胰岛素抵抗的因素如糖毒性，脂毒性，炎症细胞因子和氧化应激等作用于胰岛素信号转导途径中的IRS，P13K，Akt等多个分子水平，导致胰岛素通过P13K／Akt信号途径刺激内皮产生NO减少，内皮功能紊乱及骨骼肌等外周组织摄取葡萄糖能力下降，血糖升高。因此，机体释放更多的胰岛素以维持血糖稳态。但是，胰岛素的MAPK信号途径通常不受影响。代偿性高胰岛素血症激活MAPK通路，增强丝裂原活性[641。在内皮细胞中，表现为刺激血管收缩因子ET-1的释放。有研究证实，ET-1可以拮抗胰岛素促进骨骼肌的葡萄糖摄取作用【81，82】。因此在病理条件下，NO活性减弱，ET-1的作用增强，也进一步加重内皮功能紊乱。由此可见在正常生理条件下，胰岛素通过P13K．Akt途径在内皮细胞中促进NO释放介导血管舒张，在骨骼肌细胞中刺激GLUT4转位促进葡萄糖摄取，两者具有协同作用。而在病理条件下，糖脂毒性，炎症细胞因子及氧化应激等导致内皮功能紊乱和胰岛素抵抗，两者具有相互促进的作用，形成恶性循环。 复旦大学博士学位论文选择性P13Kmit途径受损MAPK管P13Kt；+I组织间血流灌注减低IETI拿NO、-．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．。．．．．．．．．。．．√’-．．．．．．．．．．．。．。。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一图1．3胰岛素抵抗与内皮功能紊乱互相促进并导致糖尿病及心血管疾病的发生1．5衔接蛋白APPLlAPPLl，是一个含有N端BAR结构域，中心PH结构域，C端PTB结构域的衔接蛋白。首先通过Akt2作为诱饵的酵母双杂交实验中被鉴定。被命名为AdaptorproteincontainingPleckstrinhomology(PH)domain，Phosphotyrosinebinding(PTB)domainandLeucinezippermotif1，简称APPLl。1．5．1APPLl与胰岛素信号转导APPLl与胰岛素信号转导通路中多个信号分子相互作用，包括Akt[83，84]和P13K[85，86]的p110，p85亚基。在C2C12骨骼肌细胞中，过表达APPLl可以增加胰岛素刺激的Akt磷酸化，相反，敲低APPLl则降低胰岛素刺激Akt磷酸化[83，87]。与肌肉细胞中的结果一致，在3T3．L1前脂肪细胞中，APPLl与Akt相互作用，介导胰岛素刺激Akt磷酸化和Glut4转运。在肝脏细胞中APPLl还可以通过增强Akt活性抑制肝糖输出[88]。这些结果都证实了，APPLl直接参与胰岛素的信号转导，在Akt活化，GLUT4转位及葡萄糖摄取中起着重要的作用。1．5．2APPLl介导脂联素的胰岛素增敏作用APPLl的PTB结构域可与脂联素受体112(adiponectinreceptor1／2，AdipoRl／2) 复旦大学博士学位论文的胞内段相互作用[87，89]。在C2C12骨骼肌细胞中，用脂联素和胰岛素共同处理细胞可以协同增加mkt的磷酸化水平。然而，敲除APPLl后，此协同效应消失[87]。因此，APPLl在脂联素和胰岛素的信号通路的串扰中及调节脂联素的胰岛素增敏效应，起着不可或缺的作用。1．5．3APPLI作为脚手架蛋白参与多条信号转导通路现有的研究证实APPLl与包括膜受体和胞内信号分子等多个蛋白相互作用，表明衔接蛋白APPLl参与多种信号通路。APPLl的PTB结构域与多个膜受体相互作用介导受体后信号转导。如DCC[85]，雄激素受体(androgenreceptor，AR)[86]，卵泡刺激素受体(Follicle．stimulatinghormone，FSH)[90，91]，及TrkA[92]等。除此之外，近期的研究还证实，Cdo与APPLl相互作用通过p38MAPK促进成肌细胞分化[93]。APPLl的BAR结构域还可与小G蛋白Rab5相互作用[94]，并介导APPLl向内吞体(endosome)的定位[95]。在细胞核内，APPLl还可以与核小体重构和组蛋白去乙酰化复合物(NuRD／MeCPl)相互作用，参与调节基因转录和增殖[94】。APPLIAdipoRl一’2FSI-IR1．5．4APPLl与血管内皮功能彻搿如。occo确峨。唧Ⅵ一系列研究提示了APPLl在调节血管内皮功能中的重要作用，在内皮细胞中，APPLl通过AMPK-eNOS活化增强脂联素诱导的NO生成[891。且在抑制内皮细胞调亡，增强内皮祖细胞的功能中起重要的作用。最近的研究发现，在肥胖的db／db小鼠[89]和Zucker大鼠[96]的肠系膜动脉中，APPLl的表达水平降低。最新的一项在中国汉族人群的研究中发现，APPLl的基因多态性与2型糖尿病患者中冠状动脉疾病的发病风险有关[971。 复旦大学博士学位论文1．6主要研究目标综上，之前的研究表明，APPLl在增加胰岛素敏感性及介导内皮细胞NO生成中有重要的作用，但是其生理功能并未得到很好的研究。此研究的主要目标为：1．研究APPLl在调节胰岛素血管功能中的作用2．探讨APPLl调节胰岛素在内皮细胞中信号转导的分子机制3．观察过表达APPLl对整体胰岛素敏感性的影响14 复旦大学博士学位论文材料与方法2．1材料2．1．1血管功能实验所需激动剂及阻断剂Drugs购买来源U46619Sigma(stLouis，MO，USA)L．NAMESigma(StLouis，MO，USA)LY294002Sigma(StLouis，MO，USA)PD98059Sigma(StLouis，MO，USA)BQl23Sigma(stLouis，MO，USA)AchCaymanChemical(AnnArbor，MI，USA)SNPCaymanChemical(AnnArbor，MI，USA)BKSigma(StLouis，MO，USA)InsulinNova-NordiscAdiponectinIn—houseproduction2．1．2SDS．PAGE，Westernblotting，DNA电泳所需缓冲液(或试剂)组成配方：15 复旦大学博士学位论文缓冲液配方分离胶缓冲液(4×)2．0MTris—HCl，pH8．8，0．4％(w／v)SDS积层胶缓冲液(4X)1．0MTris-HCI，pH6．8，0．4％(w／v)SDS聚丙烯酰胺溶液30％(w／v)聚丙烯酰胺10％SDS溶液10％(w～)SDS心10％(w／v)APTEMED1XSDS电泳缓冲液20mMTris，144mMglycineandO．1％(w／v)SDS20mMTris，144mMglycineand20％(v／v)转膜缓冲液methanol50mMriffs-HClpH7．4，150mMNaCl，1XTBST0．1％Tween20封闭液5％脱脂牛奶或1％BSA0．25MTris—HClpH6．8，50％(v／v)甘油，SDS。PAGE上样缓冲液15％(w／v)SDS，0．05％(w／V)溴酚蓝，5％(v／v)13巯基乙醇(B-ME)．PVDF膜再生液62．5mM"Iris—HCIpH6．7，2％(w／v)SDS，16 复旦大学博士学位论文100mMB．ME20％(V／V)methanol，10％(v／v)aceticacid，考马斯亮蓝染液and0．1％(w／v)CoomassieBrilliantblueR-250考马斯亮蓝洗脱液20％Q|吣ethanoland10％aceticacid137mMNaCl，2．7mMKCl，4．3mM1x磷酸盐缓冲液(PBS)Na2HP04，1．4mMKH2P04，pH7．4DNA上样缓冲液(6×)0．25％(w～)溴酚蓝，0．25％(w／v)二甲苯胺，40％(w／v)蔗糖TBE缓冲液80mMTris，2mMEDTA，pH8．0TBS缓冲液100mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7．4．50mMTris-HCl，pH7．4；150mMNaCl；1mMNa2EDTA，1mMEGTA；1％NonidetP一40(uP一40)，1％sodiumdeoxycholate；2．5mMsodiumpyrophosphate；1mMRIPA裂解液13-glycerophosphate；1mMNa3V04，1mMNaF,1mMPMSF,IxsolutionofProteaseInhibitorcocktailtablet(Roche，Mannheim，Germany)2．1．3SDS-PAGE，Westernblotting,DNA电泳所需缓冲液(或试剂)购买来源：试剂购买来源17 复旦大学博士学位论文BenchMarkPre．stainedProteinLadder(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，蛋白MarkerCalifornia,USA)PageRulerTMPre．stainedProteinLadder(Fermentas，BurlingtonOntario，Canada)AmershamBioscienees，Buckinghamshire，PVDF膜UnitedKingdomGEHeahhcare，Buckinghamshire，UnitedECLPlus／Advance化学发光试剂盒KingdomX．线片Fuji，Tokyo，Japan2．1．4细胞培养及转染所需试剂试剂来源肝素B．BRAUNMedicalInc．(USA)内皮细胞生长因子BDBioscience(MA，USA)1％GelatinSigma(StLouis，Missouri，USA)胎牛血清Gibco，Invitrogencorporation(NYUSA)DMEM培养基Gibco，Invitrogencorporation(NYUSA)M199培养基Gibco，Invitrogencorporation(NYUSA)18 复旦大学博士学位论文Opti—MEM培养基Oibco，Invitrogencorporation(NYUSA)(0．1％)胰酶Gibco，Invitrogencorporation(NYUSA)InsulinNovo-Nordisk(USA)LipofectamineInvitrogencorporation(NYUSA)Lipofectamine2000Invitrogencorporation(NYUSA)2．1．5抗生素种类，浓度及购买来源抗生素浓度购买来源Stocksolution100mg／mLUSBCorporation，氨苄霉素Workingsolmion100pg／mLCleveland，USAStocksolution100mg／mLUSBCorporation，卡那霉素Workingsolution100Itg／mLCleveland，USAStocksolution45m酌[IlLUSBCorporation，氯霉素Workingsolution45}tg／mLCleveland，USAStocksolution60mg／mLSigma-Aldrich，StLouis，盘尼西林Workingsolution0．06medmLMissouri，USASolutionmixtureof60me．／mlpenicillin，PSF(100x)130mg／mlstreptomycinsulfateand0．819 复旦大学博士学位论文mg／mlgentamicinsulfate．2．1．6细胞系及来源细胞系来源CambrexBioScienceInc．，Walkersville，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Mrayland，USA人胚肾细胞(HEK293)ATCC，Manassas，Virginia,USA2．1．7细菌种系及来源种系来源PromegaCorporation，Madison，Wisconsin，DH50rUSABL21Invitrogen，Carlsbad，Califomia,USAXLl0．GoldStratagene，LaJolla,California,USA2．1．8细菌培养基种系购买来源20 复旦大学博士学位论文LBbrothUSBCorporation，Cleveland，USALBbroth、析tllargarUSBCorporation，Cleveland，USA2．1．9Westernblotting及免疫共沉淀所需抗体抗体来源CellSignalingTechnologyInc．Rabbitanti—phospho—Akt(Ser473)(MA，USA)CellSignalingTechnologyInc．Rabbitanti—totalAkt(MA，USA)Rabbitanti—phospho呻44|42MAPK(ThrCellSignalingTechnologyInc．202／Tyr204)(MA，USA)CellSignalingTechnologyInc．Rabbitanti-totalp44／42MAPK(MA，USA)Mouseanti-phospho-eNOS(Ser177)BDBiosciences(CA，USA)Mouseanti-totaleNOSBDBioscienees(CA，USA)SantaCruzBiotechnologyRabbitanti．TRB3(California，USA)Mouseanti—B-actinSigma(SaintLouis，USA)21 复旦大学博士学位论文Mouseanti．FLAGSigma(SaintLouis，USA)Rabbitanti．HASigma(SaintLouis，USA)Goatanti-mouseconjugatedwithSigma(SaintLouis，USA)horseradishperoxidaseGoatanti-rabbitconjugated、析tllhorseradishSigma(SaintLouis，USA)peroxidaseRabbitanti—APPLlInhouseproduction2．1．10蛋白表达或腺病毒包装载体载体来源pcDNA3．1(+)Invitrogen(CA，USA)pET-21avectorInvitrogen(CA，USA)pshuttlevectorStratagene(CA，USA)pAdeasy一1vectorStratagene(CA，USA)pCAGGSvectorFromDr．J．Miyazaki2．1．11mRNA抽提，逆转录PCR，Q．PCR所需试剂 复旦大学博士学位论文试剂购买来源TRIzol@Invitrogen，Carlsbad，California,USAImProm．IITMReverseTranscriptionSystemPromegaCorporation，Madison，USASYaR*GreenERTMqPCRSupermixInvitrogen，Carlsbad，California,USA2．1．12Q．PCR(SYBRGreen)引物序列基因序列Sense：5’GATTCTGTTGGACTGGCAAA3’APPLlAnti．sense：5’TGCTGAGCTCTTTCTGCTGT3’Sense：5’．TTCCCGTGATCTCTCTGCT．3’ET-1anti．sense：5’．TCTGCTTGGCAGAAATTCCA．3’Sense：5’．ACCCAGAAGACTGTGG√气TGG一3’GAPDHanti—sense：5’．CACArTGGGGGTAGGAACAC一3’Sense：5’．CGACTCAGTCCAAGAGTACTTCTCTTC．3’UCP．1Anti．sense：5’一GCCGGCTGAGATCTTGTTTC一3’ 复旦大学博士学位论文2．2方法2．2．1实验动物：C57BL／6J小鼠，APPLl转基因及基因敲除小鼠被用于此实验。其中C57BL／6J购自香港大学实验动物部，APPLl转基因小鼠由合作研究者建立，APPLl基因敲除小鼠由广州生物研究所建立。建立APPLl转基因及基因敲除小鼠。首先，克隆人类APPLlcDNA，并连接到pCAGGS载体上。pCAGGS载体含有一个CMV-IE启动子及一个B-actin启动子，是用于构建过表达转基因动物的常用载体。克隆好的载体含有CMV-IE．B．actin启动子，APPLleDNA和一个B．actin多聚A尾(图2．1)，将此载体注射入F1代胚胎中(C57BL／6JXCBA)。APPLl转基因小鼠用PCR方法进行鉴定。4．4kb●l-——————————————————————————————————————————————————————————◆图2．1：APPLl转基因小鼠载体构建模式图用于建立APPLl基因敲除小鼠的基因组来源于C57BL／6J种系。打靶载体(ABRLFn-pBR32)，左臂(4．7kb)及右臂(4．2kb)分别包含APPLl第17个内含子和第19．21个外显子。线性化的打靶载体被转入CJ7(129SV／J)的胚胎干细胞中(图2．2)。PCR鉴定打靶正确的克隆显微注射入C57BL／6J小鼠体内。24 复旦大学博士学位论文上ar殳eted10CUS匿受誓口至三[二lNe。匠玉巫互]覆圈图2．2：APPLl基因敲除小鼠载体构建模式图上述小鼠均回交6代以上，达到C57BL／6J基因背景。实验中所有动物实验方法均由香港大学动物伦理委员会批准。所有小鼠饲养于室温(21℃±1℃)，明暗周期为12小时(早7：00明，晚19：oo暗)的环境中。除注明高脂喂养的小鼠给与高脂饮食((ResearchDiet，20kcal％protein，45kcal％fatand35kcal％carbohydrates)，其余小鼠均喂给标准饮食(20kcal％protein，10kcal％fatand70kcal％carbohydrates)，自由饮水。2．2．2小鼠基因型及表型鉴定：小鼠基因型由PCR法检测基因组DNA来鉴定，方法如下：1．在EP管中加入100ulDirectPCR(加蛋白酶)试剂，及小鼠组织(少量耳朵或尾巴组织)。2．放入55。C水浴中震荡过夜3．加热至95。C1小时，灭活蛋白酶。即得到小鼠基因组DNA，储存于4"C待用4．PCR法利用特异引物扩增基因：基因组DNA：0．5ulprimerFor：0．5ul25 复旦大学博士学位论文I沁v：0．5ul5Xbuffer：5uldNTP：0．5ulTaq酶：0．5ulddH20：18ul总体积25ul，混匀上95℃5min上(95"Clmin+55。Clmin+72*(2lmin)X35上72℃10min5．PCR产物用1．5％琼脂糖电泳，在紫外光下显影，拍照。小鼠表型鉴定，每周称量小鼠体重，计算进食量，体温，氧消耗等数据用代谢笼测得。小鼠血糖，ipGTT等数据由IbcheACCU-CHEKIfll糖仪测定，ipGTT步骤如下：1．小鼠首先饥饿过夜(16d,时)2．次日，称量小鼠体重，并测定尾静脉血糖(空腹)。3．按照0．5g葡萄糖／kg体重，腹腔注射。4．分别在注射后15min，30min，45min，60min，90min测定鼠尾静脉血糖。5．测定血糖同时，由尾静脉取血20ul用于胰岛素测定。2．2．3血管功能实验小鼠用苯巴比妥钠(140mg／ml／kg体重)腹腔麻醉。小心分离胸主动脉(主动脉根部至横膈)及肠系膜上动脉(腹主动脉肠系膜上动脉分支处及其分支，与整副肠管从十二指肠至直肠)，至于4"C改良型克一林格氏液(ModifiedKrebs—RingerSolmion)中(119mMNaCI，4．7mMKCI，2．5mMCaCl2，lmMMgCl2，25mMNaHC03，1．2mMKH2P04，andllmMD．Glucose)。显微镜下分离动脉旁脂肪及纤维结缔组织，防止任26 复旦大学博士学位论文何扯拉或钳夹等机械性损伤损坏血管内皮细胞。分离好的血管一部分用于血管收缩舒张功能实验，另一部分直接用液氮冻存，储存于．80。C冰箱中用于免疫印迹或其它实验。第一序列及第二序列的肠系膜上动脉的分支血管为阻力血管，直径多小于100unl。肠系膜动脉与静脉常伴行，通过下列方法可在镜下区分动脉与静脉，首先，静脉分叉处呈“U"形，而动脉呈“V”形。其次，静脉由于管壁薄，管腔内血液被充分氧饱和后呈鲜红色，而动脉则呈紫红色。再次，可根据血管弹性来判断，静脉较软，而动脉较韧。在显微镜下去除脂肪和纤维结缔组织后，切成-2mm的血管环，按照说明固定于血管张力测定仪(Wire．Myograph)上。固定好的血管环如下图所示：37℃recorder图2-3：血管环连接血管张力测定仪示意图 复旦大学博士学位论文器官浴槽内加入O．8IIll温浴的(37"C)，充气的(95％02，5％C02)克氏溶液。血管张力由转换器(ADInstruments，Sydney，Australia)连接到张力记录仪(PowerLab，ADInstrument)。连接好的血管环给于0．59的力，每隔15min更换Krbs，并调整基础力稳定至0．59。在Krbsqb稳定ld,时后，在KrbsqbJJll／x,两次60mM的KCL，以获得K离子引起的最大收缩。之后用Krbs冲洗3次去除溶液中过量的K离子。血管环首先用lOnmoFLU46619收缩来检测血管的收缩张力，在达到平台期后，加入lOumol／LACh检测血管内皮的完整性，如lOumol／LACh引起大于95％的血管舒张，则认为血管内皮是完整的。在一些血管环中，利用机械摩擦血管腔内面的方法去除内皮细胞，10umol／LACh不能诱导舒张。如果血管环符合所需收缩(舒张)功能要求后，可继续后续实验。研究血管的舒张功能，首先用10nMU46619引起持续性血管收缩，到达平台期后，逐步加入不同浓度的血管舒张剂，胰岛素(insulin)，乙酰胆碱(ACh)，SNP，缓激肽(Bradldndney)，钙离子类似物(A23187)等。由血管张力记录仪记录血管张力变化。研究血管收缩功能，除上述步骤外，在器官浴槽内逐步加入不同浓度的血管收缩剂，记录血管张力变化，用于分析。研究各种阻断剂对血管收缩，舒张功能的影响，先在器官浴槽内加入不同的阻断剂，孵育30分钟后，利用上述步骤观察血管收缩，舒张功能变化。2．2．4细胞培养人脐静脉内皮细胞系(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HIJVECs)，选取第4．6代用于实验研究。培养条件：M199培养基，加15％胎牛血清，O．1mg／ml肝素，100U／ml青霉素，100ug／ml链霉素和O．03mg／ml内皮细胞生长因子。．人胚胎肾细胞系(Humanembryonickidney293，HEK293)培养条件：DMEM培养基，加10％胎牛血清，100U／ml青霉素和100lag／ml链霉素．细胞培养孵箱条件：37℃，C02浓度为5％。培养基每3天更换一次。细胞传代，当培养皿中细胞达到融合后，需对细胞进行传代，步骤如下 复旦大学博士学位论文1．弃去旧的培养基，用1XPBS清洗一次2．加入1mlO．1％的胰酶，均匀覆盖细胞表面，放入孵箱中1-2min。3．取出在显微镜下观察细胞，如细胞已开始收缩，变圆，轻微震荡细胞，使其离壁。4．加入3llll含有血清的培养基，终止胰酶消化5．反复吹打细胞，使其悬浮6．细胞在1500rpm离一t]qomin，弃去含有消化液的培养基。7．重新加入培养基使其悬浮。接种于新的培养皿中。9．前后摇匀后，至于细胞培养箱中。转染细胞的步骤如下：1．细胞种于6孔板中，长至达到70％融合2．1．5ugDNA及6ullipofectamine分别用100ulopti—MEM稀释，室温孵育5min。3．将稀释过的DNA及lipofectamine混合，室温孵育30min。4．将上述混合液加入600ulopti．MEM培养基，并加入各孔中。5．6小时后，加入全培养基。2．2．5组织蛋白抽提分离的血管环置于器官浴槽中，维持37。C恒温及持续通氧，给于lOOnM胰岛素刺激后，收获血管，置于液氮中快速冷冻，并储存于．80。C冰箱中保存。收集好的血管组织，加入RIPA组织裂解液，在4。C冰上超声裂解(20V，5S／次，共4次)。观察组织是否裂解充分，可适当重复超生裂解步骤。超声裂解完全后，置于冰上15min，29 复旦大学博士学位论文使组织蛋白充分溶解于RIPA裂解液中。预冷Ependorf低温离心机，13200rpM离心10min，收集上清。用BCA法测定蛋白浓度(PierceBiotechnologyIne．，Rockford，USA)。2．2．6蛋白免疫印迹(Westernblotting)总蛋白量相等的各组织进行SDS．PAGE电泳，步骤如下：SDS．PAGE胶的制备12％分离胶的配制ddH20：30％丙烯酰胺溶液：1．5ml／LTris(PH8．0)：10％SDS：10％过硫酸铵：TEⅣ匝D：8．2ml10．0ml6．3ml0．25ml0．01ml按上述比例依次混合各成分，迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注积层胶所需空间。随后小心的在丙烯酰胺溶液上覆盖一层异丙醇，将凝胶垂直放置于室温下聚合约20分钟。待分离胶聚合完全后，倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，尽可能排去凝胶上的液体，用纸巾的边缘吸净残留液体，按下法制备积层胶。5％积层胶的配制ddH20：30％丙烯酰胺溶液：1．0ml／L嘶S(PH6．8)：10％SDS：10％过硫酸铵：TEMED：303．4mlO．83mlO．63ml0．05mlO．05ml0．005ml 复旦大学博士学位论文按上述比例依次混合各成分，在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充满梳子之问的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合约20分钟。SDS．PAGE电泳当积层胶聚合后，小心移出梳子，用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris．甘氨酸电泳缓冲液。把样品置于2×SDS凝胶加样缓冲液中，沸水煮沸10分钟，依次将样品加到样品孔底部，接通电源，电压150v的条件下电泳直至溴酚兰到达分离胶底部(约4小时)。转膜过程如下：1．将凝胶放入去离子水中漂洗数秒。2．剪4张Whatman3mm滤纸和1张PVDF滤膜，其大小与凝胶大小完全吻合，将膜浸泡在去离子水中5分钟，将3mm滤纸浸泡在转移缓冲液中5分钟。3．在电极支架上放上海绵垫，其上放2张3mm滤纸，叠放整齐，赶净气泡，将硝酸纤维素膜放在3mm滤纸上，注意膜与滤纸之间不要有气泡，再将凝胶准确放在膜上，最后将2张3mm滤纸放在凝胶上面并确保各层精确对齐和没有气泡。4．将有膜的一面朝阳极安装转移装置，接通电源，100伏转移约2小时。5．取下膜，标记正反面，1×TBST中洗涤5min。6．封闭：将膜放入5％脱脂奶粉的封闭液中，室温封闭1小时。7．洗膜：封闭之后，用1×TBST洗涤3次，每次10min。8．抗体抗原反应：将合适浓度的抗体加入到封闭液中，再将膜放入其中，于4"C平缓摇动过夜。9．洗膜：用1×TBST洗涤3次，每次10min。10．二抗反应：根据厂家说明将二抗(与辣根过氧化物酶共价偶联)按照一定比例稀释到封闭液中，再将膜放入其中于室温平缓摇动1小时。 复旦大学博士学位论文11．洗膜：用含有1×TBST洗涤3次，每次10min。曝光：在暗室内，按照厂家说明配制ECL，于室温轻轻摇动温育，5min后，吸去多余ECL，压片。13．依次按显影液，定影液，清水处理胶片，晾干。2．2．7免疫共沉淀1．收获转染后的细胞，按照蛋白抽提步骤加入裂解液，12000rpm4。C离心15分钟。2．收取上清液，加入50ul蛋白A／Gbeads4。C孵育1小时，去除非特异性结合。3．离心，收取上清，加入抗体4。C孵育过夜。4．次日加入蛋白A／Gbeads4"C孵育2小时，沉淀免疫复合物。5．beads用lml蛋白裂解液洗涤4次。6．结合与beads的免疫复合物加入100ulSDS．PAGE上样缓冲液煮沸。7．免疫复合物将用SDS．PAGE分离，转移至PVDF膜。8．用特异性抗体检测目标蛋白。2．2．8RNA抽提1．匀浆器和镊子等器皿在220。C干烤4小时，以去除RNA酶。2．取适量TRIz01分别加入15ml离心管。3．从液氮中分别取出组织，迅速放入上述离心管中，匀浆约20秒。4．将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿(每lmlTRIzol加入氯仿200u1)，12000rpm4。C离心20min分层。32 复旦大学博士学位论文5．将上层水相转入另一无RNA酶的离心管中，加入等体积异丙醇，12000rpm4。C离心30min沉淀RNA。75％的乙醇洗涤沉淀。7．以适量无RNA酶的去离子水溶解沉淀。8．紫外分光光度计测定OD260／280比值并定量。2．2．9逆转录cDNA取组织总RNA约lug，体外逆转录合成eDNA。逆转录过程如下：RNA：2ul(500ng／u1)OilgDT：lulDEPC．H20：9ul总体积：12ul上70。C10分钟上置冰上，短离心后加入5一FirstBandBuffer：4ulDTT：2lddNTP：lul混匀，42。CSuperscriptII上42。Cl◆700CI◆2分钟后加入lul混匀60分钟15分钟--20。C保存备用33 复旦大学博士学位论文2．2．10实时定fPCR实时定量PCR汞J用SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)及ABIPrism7000仪器(AppliedBiosystems)i贝lJ定。反应条件如下2．2．11NO，ET-1鉴定CDNA：lulprimerFor：O．5ulI沁v：0．5ulSYBRGreenMix：10ulDEPCH20：8ul混匀，50。C2分钟上95。ClO分钟上(95。C15s+60。Clmin)X35JABIPriRm7000将内皮细胞种于6孔板中，生长达到90％融合后，更换为无血清培养基，饥饿6小时，细胞用不同浓度的胰岛素刺激后，分别在不同时间点收集上清液。NO生成用SieversNO分析仪((Boulder,CO)分别测定nitrite(N02-)和nitrate(N03-)浓度来检测。ET．1浓度用ELISA试剂盒检测(R&D)。2．2．12ipGTT和ITT糖耐量试验：1．小鼠被放置在清洁的笼子内，去除食物，但可以自由饮水，饥饿过夜(12d'时)。 复旦大学博士学位论文2．次日，小鼠承重。尾静脉采血，测定空腹静脉血糖3．按No．59葡萄糖／kg体重腹腔注射葡萄糖。4．按着注射时间起计时，分别在第15min，30min，45min，60min及90min用罗氏快速血糖仪测定尾静脉血糖。胰岛素耐量试验：1．小鼠被放置在清洁的笼子内，去除食物，自由饮水，饥饿6d,时(早8：00～下午14：00)。2．按照1U／kg体重腹腔注射胰岛素3．按着注射时间起计时，分别在第15min，30min，45min，60min及90min用罗氏快速血糖仪测定尾静脉血糖。2．2．12数据分析所有的数据以Mean___SEM来表示，图表用Graphpad5．0软件制作，两组问差异用Student’Stest检测，多组比较用one-wayANOVA检测。P值小于0．05表示有统计学差异。 复旦大学博士学位论文第一部分APPLl通过平衡No和ET一1产生改善肥胖诱导的血管胰岛素抵抗3．1引言胰岛素不仅仅可以调节葡萄糖代谢稳态，也在调节血管活性中发挥着重要的作用[981。在血管系统中，胰岛素既可以通过促进内皮细胞产生一氧化氮(NO)介导血管舒张，又可以促进内皮源性的血管收缩因子，如内皮素．1(ET-1)的释放，介导血管收缩[99】。胰岛素刺激内皮细胞产生NO主要通过P13K—Akt信号途径，从而激活内皮一氧化氮合酶(eNOS)[100】。另一方面，胰岛素刺激血管收缩因子ET-1的表达和释放增多则是通过内皮细胞中ERKl／2MAPK的信号激活【39】。内皮产生血管舒张因子(如NO)和血管收缩因子(如ET-1)之间的平衡对于维持健康状态下代谢和循环稳态有着重要的意义[98]。血管胰岛素抵抗，主要是指胰岛素的血管舒张功能受损及血管收缩功能增强，是连接肥胖，糖尿病和心血管疾病的重要现象[101，102]。在胰岛素抵抗的状态下，如衰老和肥胖，胰岛素诱导P13K．Akt的活化特异性受损，而MAPK的信号却被保留下来甚至进一步增高[103]。内皮功能紊乱可以减少胰岛素敏感组织(如肌肉)中的血流来影响葡萄糖代谢[104]，因此，内皮功能紊乱不仅仅是高血压和动脉粥样硬化的危险因素，也是促进代谢紊乱的主要因素。一些动物实验及临床研究也表明，胰岛素抵抗和内皮功能紊乱之间形成恶性循环，相互促进并导致糖尿病或心血管疾病的发生发展。因此，逆转胰岛素的血管收缩作用向血管舒张作用转变，可能会成为有效治疗胰岛素抵抗和内皮功能紊乱的作用靶点[105】。但是，可以调控胰岛素刺激NO和ET-1产生平衡的分子机制尚未阐明。APPLl，是一个含有N端BAR结构域，中心PH结构域，C端PTB结构域的衔接蛋白。首先通过Akt2作为诱饵的酵母双杂交实验中被鉴定[851。一些研究表明APPLl在介导胰岛素刺激的骨骼肌和脂肪细胞葡萄糖摄取中起着重要的作用[87，106】，另外还可以抑制肝脏糖原输出【88】。另有一些研究表明，APPLl通过与脂联素受体直接相互作用，从而介导脂联素的胰岛素增敏作用【87，89】。在内皮细胞中，APPLl通过AMPK．eNOS活化增强脂联素诱导的NO生成【89]。且在抑制内皮细胞调亡，增强内皮祖细胞的功能中起重要的作用。最近的研究发现，在肥胖的db／db小鼠[891和Zucker大鼠[96】的肠系膜动脉中，APPLl的表达水平降低。综上，之前的研究表明，APPLl在介导内皮细胞NO生成中有重要的作用，但是36 复旦大学博士学位论文其生理功能并未得到很好的研究。此研究的主要目的是利用APPLl转基因和基因敲除小鼠，研究APPLl调节胰岛素血管活性的机制。37 复旦大学博士学位论文3．2技术路线m管功能试验(MYOGRAPH)胰岛素刺激的瓶管舒张／收缩Westernblot检测Akt／eNOS，ERKI／2磷酸化水平 复旦大学博士学位论文3．3结果3．3．1FLAG．APPLl在转基因小鼠血管组织中成功表达不论在肥胖型小鼠或大鼠的肠系膜动脉血管中，APPLl的表达水平均明显降低[89，96】。为了研究APPLl在调解血管活性的病理生理作用，通过转基因技术，在小鼠体内成功过表达FLAG标记的APPLl，具体实验方法见(2．2．1)。FLAG．APPLl在小鼠中的成功表达用PCR的方法进行鉴定(图3．1A)。western-blotting检测肠系膜动脉组织中APPLl的表达水平，结果显示，与野生型对照相比，转基因小鼠组织中APPLl表达水平升高约2．5倍左右(图3．1B)。。4BMTGWTTG◆mlti-APPL1删黼}1|l《-mlti．FLAG獭懒糍mlti．actin镧嘲黪期—嘲麟图3．1FLAG．APPLl在转基因小鼠中成功表达。(A)利用direct—PCR试剂提取小鼠基因组DNA，用特异性引物扩增FLAG—APPLl片断。PCR产物约为400bp。(B)收集小鼠血管组织，抽提蛋白进行westernblotting分析，分别用抗一APPLl，抗-FLAG，及抗．actin抗体检测组织内APPLl表达水平。M=Marker，TG=转基因型，WT=野生型。3．3．2在APPLl转基因小鼠肠系膜动脉中，过表达APPLl选择性增强胰岛素诱导的内皮依赖的血管舒张在8周龄野生型小鼠中，胰岛素引起剂量依赖性的血管舒张。胰岛素在年轻，非肥胖的小鼠动脉血管中，以引起内皮依赖的血管舒张作用为主，这一作用主要是由NO的释放增多介导的。在同样周龄的APPLl转基因小鼠中进行同样的实验，过表达APPLl39 复旦大学博士学位论文可以增强胰岛素介导的血管舒张的敏感性(图3．2A)。由图示我们可以看到，在U46619引起持续性血管收缩后，逐步加入胰岛素刺激血管舒张，APPLl转基因小鼠的肠系膜动脉在生理剂量下的胰岛素刺激下的血管舒张大于野生型对照组，(1nmol／Linsulin：28．3±3．7％VS．44．6±5．9％p<0．05；10nMinsulin：54．1±6．7％VS．66．7±5．8％，p<0．05)．同样，在APPLl转基因小鼠组，胰岛素引起血管舒张的EC50明显低于野生型对照组(1．9±0．4VS．8．1±1．2nM，p<0．01)。但是，在两组小鼠中，超生理剂量的胰岛素引起的最大血管舒张并无明显差别。在用机械摩擦去除血管内皮后，胰岛素引起的血管舒张效应不论在APPLl转基因小鼠或是在野生型对照小鼠中均消失(图3．2B)，这说明，APPLl增强胰岛素引起的血管舒张呈内皮依赖效应。此外，通过在器官浴槽中加入多种阻滞剂：NOS阻滞剂[L-NAME(100lxmol／L)]，Akt5H滞剂[Akt．I．1(5gmol／L)】或者P13K阻滞剂【LY294002(5lxmol／L)]，均可大大降低胰岛素引起的血管舒张，且APPLl转基因小鼠与野生型对照组相仿。这一结果说明，APPLl主要是通过激活P13K-Akt—eNOS的信号途径来增强胰岛素介导的血管舒张的。0100-11_10-9-8-7-6insulin(109M)+WT"41-TG—W1通C～TG-EC2468目。一_u意’I¨_【IooQ．I(Io_羹A量鼍鲁。堇do萋 复旦大学博士学位论文B譬星譬．葛黾i爱——_奉+一W．血■TGfll广．憎J工图3．2转基因过表达APPLl对胰岛素诱导的肠系膜动脉舒张的影响。(A)在wire．MYOGRAPH系统中，U46619诱导稳定收缩后，测定8周龄APPLl转基因小鼠和野生型对照小鼠对胰岛素的剂量反应。数据以引起舒张的百分数来表示。(B)分别加入P13K阻滞剂[LY294002(5I_tmol／L)]，Akt阻滞剂[Akt．I．1(5肛mol／L)】，NOS阻滞剂[L-NAME(100l^mol／L)]或者去除血管内皮后对胰岛素诱导APPLl转基因小鼠和野生型对照小鼠离体血管舒张作用的反应。数据用曲线下面积表示。}P