mir-34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究

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1、硕士学位论文论文题目MiR-34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究研究生姓名王娜指导教师姓名柴忆欢教授专业名称儿科学研究方向儿童血液论文提交日期2013年3月MiR-34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究中文摘要MiR-34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究中文摘要目的：研究miR-34b在儿童急性白血病中的表达及其启动子区CpG岛甲基化状态，探讨其临床意义。同时检测miR-34b对细胞增殖是否有影响，进一步了解其生物学功能。方法：8种白血病细

2、胞株（U937，HL-60，MV4-11，M2R，K562，Raji，CCRF，DAMI），儿童初诊急性白血病（AL）患儿骨髓标本87例，其中初诊急性淋巴细胞性白血病（ALL）患儿55例，初诊急性髓系白血病（AML)患儿32例，正常对照患儿43例。提取细胞株或其骨髓标本总RNA，并进行引物特异性逆转录成cDNA，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对miR-34b进行检测，循环阈值(Ct值)比较法+进行miRNA表达定量分析。统计分析白血病细胞株、初诊AL、ALL、AML及MLL各组患儿miR-

3、34b表达是否有差异，并根据临床资料进行进一步分析，以探讨miR-34b在儿童初诊AL、ALL及AML的意义。同时提取细胞株或其骨髓标本DNA，进行重亚硫酸氢钠修饰基因组DNA，运用甲基化特异性PCR（MSP）检测miR-34b启动子区CpG岛甲基化状态，并通过甲基转移酶抑制剂（5-aza-2-dC）处理HL-60及K562进一步检测其甲基化状态，结合临床资料进一步统计分析儿童初诊AL、ALL及AML与其甲基化状态是否相关。采用脂质体转染hsa-miR-34bmimics到K562细胞，通过流式细胞仪检

4、测转染效率，CCK-8法检测细胞增殖情况。结果：+1、miR-34b在正常对照、白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL、AML及MLL各组的相对表达量(x±sx)分别为5.22±1.15、0.03±0.03、1.18±0.47、1.65±0.69、0.18±0.06、0.64±0.34，与正常对照组相比，儿童初诊ALL组（P<0.05）、白血病细胞株组、初诊+AL组、AML组及MLL组（P均<0.01）均有统计学差异。I中文摘要MiR-34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究2、结合

5、临床资料（如性别、年龄、免疫分型、染色体、融合基因、泼尼松实验等）做了进一步分析，发现miR-34b的相对表达量与儿童初诊ALL患儿泼尼松实验敏感与否相关（P<0.05）。3、miR-34b启动子在8种白血病细胞株中均出现甲基化现象，甲基化阳性率为100%，本实验共检测50例儿童初诊AL患儿，其中31例初诊ALL患儿，19例初诊AML患儿，其甲基化阳性率分别为64%（32/50）、77.42%（24/31）和42.11%（8/19），同时检测23例正常对照患儿，无一例出现甲基化现象。4、5-aza-2-

6、dC处理白血病细胞株HL-60及K562后，miR-34b的相对表达量均明显升高，分别为49.5倍和18.8倍，其甲基化条带均明显减弱。5、结合临床资料（如性别、年龄、免疫分型、染色体、融合基因、泼尼松实验等）做了进一步分析，发现miR-34b的甲基化状态与儿童初诊AL患儿的免疫分型相关，淋系与髓系的miR-34b的甲基化状态之间具有统计学差异（P<0.05）。6、脂质体转染hsa-miR-34bmimics到K562细胞后，流式细胞仪检测转染效率为61%，CCK-8法检测各组细胞增殖情况，发现转染hs

7、a-miR-34bmimics组48h、72h、96h及120h均出现细胞增殖抑制作用（P均<0.01），其中72h抑制作用最明显，抑制率达45.7%。结论：+1、miR-34b在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL、AML及MLL各组患儿中表达均明显减低，提示miR-34b可能作为新的抑癌基因参与儿童初诊AL、ALL及AML的形成，同时在MLL基因重排阳性儿童初诊AL的发病中可能起着重要作用，并影响其预后。2、miR-34b的相对表达量与儿童初诊ALL患儿泼尼松实验敏感与否相关，提示其是否可以作为判定儿

8、童初诊ALL危险度及预后的指标。3、miR-34b启动子在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL及AML中均出现高度甲基化现象，提示miR-34b在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL及AML中均受甲基化机制调控，可能作为新的抑癌基因发挥作用。4、5-aza-2-dC处理白血病细胞株HL-60及K562后，miR-34b的相对表达量明显升高，甲基化条带明显减弱，进一步证实miR-34b在白血病细胞株中受甲基化机制调控。5、miR-34b的甲基化状