人骨髓来源间充质干细胞的外泌体特性研究

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1、硕士学位论文学校代码：10023学号：$2011014022人骨麓来源间充质干细胞的外泌体特性研究BiologicalCharacteristicsofExosomesSerectedbyHumanBoneMarrowMesenchymalStemCells所院：姓名：指导教师：导师小组：学科专业：研究方向：完成日期：血液学研究所血液病医院冯影韩忠朝教授中法实验室组内科学干细胞基础与应用2014年5月目录课题：入骨髓来源间充质干细胞的外泌体特性研究综述间充质干细胞与其分泌的外泌体的生物学特性综述⋯⋯⋯⋯40附

2、录一主要实验仪器和试剂一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49附录二主要溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53附录三英文缩略语表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56附录四在学期间发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯595467l35723～法～要～方～献摘～与～文言料果论考中英前材结讨结参中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文人骨髓来源间充质干细胞的外泌体特性研究摘要背景：间充质干细胞(MSC)来源于早期中胚层，是具有

3、自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，它存在于多种组织中。MSC可在特定的条件下诱导分化为骨髓基质细胞如成骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞和心肌细胞等三个胚层细胞，已经成为组织工程和再生医学细胞治疗的主要候选干细胞之一。MSC具有低免疫原性和较强的免疫调节功能，可以应用于减少移植物的免疫排斥，研究肿瘤免疫，并可以用来治疗相关免疫疾病等方面。外泌体(exosome)是很小的囊泡，直径大约40-lOOnm，在生理或病理情况下，由多种细胞内膜(endosomalmembrane)以出芽方式形成的多泡体，参与细胞间的信息

4、交流，并参与到多种生理病理过程中。既往很多研究也已证明外泌体的治疗作用。现有研究已证明MSC分泌的外泌体可以减少心肌损伤范围、保护急性肾小管损伤、促进神经再生、减少肺损伤等方面有重要作用。有关MSC来源的外泌体的研究报道尚少，而对异基因MSC输注后在体内的增殖、分化、寿命以及以此带来的免疫调节功能的变化的认识尚不很明确，临床应用所产生的问题陷入瓶颈期。而对外泌体的生物特性与功能机制的深入研究对认识并解决MSC应用中产生的问题有重要作用，并且，外泌体的应用较之MSC直接应用更为安全，可以开启非细胞治疗的方法。目

5、的：本研究旨在探讨正常人骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSCs)分泌的外泌体(exosomes)免疫调节功能、支持血管形成、及造血支持能力。方法：(1)采用贴壁、传代培养的方法从正常人骨髓组织中获取相对纯化的骨髓间充质干细胞；(2)收集BMMSCP4-P6代上清提取exosome，透射电镜观察其形态，蛋白印迹法检测其表面特异标志CD9，bicinchoninicacid(BCA)方法定量检测外泌体蛋白分泌量；(3)exosomes与正常人外周血单个核细胞(

6、peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)作用72小时后用酶联免疫吸附试验法(EUSA)检测PBMC分泌的丫．干扰素(IFN吖)；(4)实时定量PCR检测外泌体内免疫相关microRNA表达；(5)共聚焦显微镜观察外泌体与人脐带静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)的作用方式，与HUVEC共培养后观察其网状结构形成：裸鼠体内试验检测exosomes对血管形成能力的作用；(6)从脐带血中磁珠分离纯化CD34+造血干细胞

7、，与exosomes共同培养一周后检测其对扩增CD34+细胞能力检测及CFU克隆形成实验。结果：正常人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体近似圆形，直径在40nm．160nm之间，1中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文表达表面标志CD9，其蛋白分泌量与接种细胞数呈线性关系，可抑制PBMC分泌IFN．y(P<0．01)，内含有免疫相关microRNA如miR301、miR22、miR—let-7a等，能促进HUVEC网状结构形成及血管形成。与脐血来源的CD34+造血干细胞共培养结果显示，BMMSCs外泌体具有

8、明显扩增CD34+细胞能力和促进CFU克隆形成能力。结论：BMMSC．exosome具有免疫调节功能、支持血管形成与造血支持作用。关键词：骨髓间充质干细胞；外泌体；免疫调节；血管形成；造血中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文BiologicalCharacteristicsofExosomesSerectedbyHumanBoneMarrowMesenchymalStemCellsAbst