伪狂犬病检测方法

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1、十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1材料准备DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录)2操作步骤2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经

2、0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。2.3病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cytopathogeniceffect,CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养

3、物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应1材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录)引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，下游引

4、物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪2操作步骤：2．1样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2mlTEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液

5、472.5μl,加入25μl10％SDS和2.5μl的20mg/ml蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。2.3.PCR的操作程序先将制备的模板DNA置100℃水浴10分钟作变性处理，，然后立即放于冰浴中。PCR反应体系为：总体积25μl，含有50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl（p

6、H9.0），0.1％TritonX-100，100μmol/LdNTPs，0.35μmol/L引物，2mmol/LMgCl2，及0.5UTaq酶，1μl模板DNA。常用的反应体系组成如下10×缓冲液2.5μl15mMMgCl22.5μldNTPs2.0μl引物各2.0μlTaq聚合酶1.0μlDNA模板2.0μl灭菌去离子水11.0μl矿物油约20μl扩増条件为:94℃变性3分钟，进入循环，94℃60秒，65℃60秒，72℃60秒，40个循环后72℃延伸5分钟。2.4PCR产物的检测PCR扩增产物在1％的琼脂

7、糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察结果。为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下观察并与标准分子量比较，可见产生的140bp和77bp两个片段。伪狂犬病荧光抗体试验1材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮（分析纯），伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录D(标准的附录)2操作步骤2．1样品采集扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如不能及时送出，必须冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可

8、用于对疑似伪狂犬病病毒的培养物进行鉴定。2．2切片制备将样品组织块切成1cm×1cm的面，不经任何固定处理，直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求5—7um，将切片展贴于0.8mm×1mm厚的洁净载玻片上。2．3固定：将切片置纯丙酮中固定15分钟，取出立即放入0.01mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗3—4次，取出，自然干燥后尽快进行荧光抗体染色。2．4染色将伪狂犬病荧光抗体滴加