亮氨酸拉链肿瘤抑制基因lzts1在结直肠癌中的作用及其分子机制的初步研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文亮氨酸拉链肿瘤抑制基因LZTSl在结直肠癌中的作用及其分子机制的初步研究Thepreliminaryroleandmolecularmechanismstudyofleucine—zippertumorsuppressorgeneLZTSlincolorectalCanCer课题来源：广东省高等学校珠江学者岗位计划资助项目(2011年)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院周薇刘思德教授内科学专业学位硕士第一，临床医学院2014年4月20日广卅硕士学位论文亮氨酸拉链肿

2、瘤抑制基因LZTSl在结直肠癌中的作用及其分子机制的初步研究硕士研究生：周薇指导教师：刘思德教授廖雯婷副教授摘要研究背景和目的结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是我国常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势。结直肠癌发生的确切原因还不知道，其发生既有先天因素也有后天原因。跟绝大多数肿瘤一样，结直肠癌的发生发展也是一个多基因发生改变的过程。在发病早期，大部分病人可通过手术治愈，但是，因为该病早期症状的不明显性以及易转移性，所以患者大多预后差。因此，加强结直肠癌发生发展及转移机制的基础研究，寻找预防和

3、治疗的有效途径，是结直肠癌研究的重要内容。亮氨酸拉链肿瘤抑制基因1(Leucine—ZipperTumorSuppressor1，LZTSl)是1999年Ishii等利用微卫星技术对原发性食管癌进行研究时发现的，位于人类染色体8p21．3附近，全长约6．8kb，包含3个外显子。该基因编码一个67kd的亮氨酸拉链蛋白，和依赖cAMP激活的转录因子5的DNA结构域具有相似性。该蛋白是富含亮氨酸重复序列超家族蛋白之一。目前分析主要存在于细胞浆中，少部分位于细胞核。据文献报道，LZTSl基因在人体正常组织中普遍有阳性表达

4、，但在50％以上摘要的肿瘤细胞巾有改变，包括膀胱癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和口腔癌等，说明该基因在多种肿瘤的发生发展中可能起着重要作用。目前认为该基因表达减少或缺失可以由基因突变、染色体缺失、启动子甲基化、组蛋白修饰或其他机制引起，从而引发癌变及肿瘤演进。但对于LZTSl基因在结直肠癌中的研究国内外鲜见相关报道。本实验室长期从事结直肠癌相关的分子机制研究，为了寻找与结直肠癌有关的特异分子标志物，阐明结直肠癌相关的分子机制，我们利用基因芯片分析，发现亮氨酸拉链肿瘤抑制基因l(LZTSI)在结直肠肿瘤组织中表达降

5、低，提示该基因的表达失调很口J‘能与结直肠癌的发生发展相关，并且LZTSl在结直肠癌中的作用及其分子机制并不清楚。本研究旨在初步探讨LZTSl基因在结直肠癌中的作用及其可能的分子机制。材料与方法1、收集南方医科大学附属南方医院2013年3月至2013年10月手术切除的结直肠癌新鲜组织标本及配对的正常结直肠黏膜组织20对，所有标本均经病理诊断确诊为结直肠癌。所有患者术前未接受放化疗。采集前通过南方医科大学附属南方医院医学伦理委员会批准及患者知情同意。2、人结直肠癌细胞株SW480、HCTl5、HT29、LSl74t

6、、DLDl采用含10％胎牛血清的RPMI．1640培养基培养：SW620、HCTll6、LOVO、293FT细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，在37。C、5％C02、饱和湿度的条件下传代培养，细胞状态良好时用于实验。3、用Real．TimePCR、Westernblot和免疫组织化学检测结直肠癌细胞株、配对结直肠癌及癌旁正常组织中LZTSl的表达。4、采用慢病毒感染的方法构建稳定过表达LZTSl的细胞株(HCTl5／LZTSl)和对照细胞株(HCTl5／pEZ．Lvl05)、以及稳定干扰LZTSl的细胞

7、株(SW480／shLZTS1)和对照细胞株(SW480／ScrambleshRNA)。5、采用MTT实验，平板克隆形成实验，软琼脂集落形成实验检测细胞增殖能硕士学位论文力及锚定非依赖生长能力；用Transwell小室侵袭试验检测细胞的侵袭迁移能力；裸鼠皮下成瘤实验观察结：卣肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力。6、用Real．TimePCR和Westernblot检测AKT、Wnt信号通路相关分子及EMT相关蛋白标志物的表达。7、采用SPSSl3．0统计软件进行数据分析。8株细胞问ACt值均数比较采用单因素方差分析(o

8、ne．wayANOVA)；结直肠癌组织和正常配对组织间LZTSl平均表达水平比较采用配对样本T检验；MTT实验采用析因设计的方差分析；荧光定量PCR、平板克隆、软琼脂集落形成实验、Transwell小室侵袭实验采用两独立样本的t检验；裸鼠皮下成瘤实验采用one．wayANOVA检验及单个因素重复测量的方差分析。试验数据用均数±标准差(i±S)表示，P<0．05为差异有统计