caveolin-1磷酸化在内毒素致小鼠急性肺损伤中的作用

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1、徐州医学院硕士学位论文Caveolin--1磷酸化在内毒素致小鼠急性肺损伤中的作用姓名：焦皓申请学位级别：硕士专业：麻醉学指导教师：刘功俭2012-04徐：川I医学院硕士学位论文Caveolin．I磷酸化在内毒素致小鼠急性肺损伤中的作用中文摘要目的观察和研究小凹蛋白．1(Caw：olin．1)磷酸化在内毒素致小鼠急性肺损伤中的作用及其潜在机制。．方法体外实验通过向稳定转染TLR4．MD2．CDl4的HEK．293细胞系和Caveolin．1(Cav．1)基因敲除小鼠的肺内皮细胞(Cav．1斗MLEC

2、s)内转染野生型Cav．1cDNA(WT)和不能磷酸化的突变型Cav．1cDNA(Y14F)，研究LPS诱发的Cav．1磷酸化对LF'S．TLR4信号通路的影响，并探索其机制。免疫印迹法检验Cav．1蛋白的表达以及Cav．1和Src激酶的磷酸化水平。检测IKB．0【蛋白的降解程度和NF．KB的激活程度。使用ELISA法检测细胞培养基中IL．6和TNF．Ⅱ的浓度。使用免疫共沉淀技术检测Cav．1和TLR4，TLR4和MyD88的相互作用及其变化。体内实验用野生型(Cav．1州+)和Cav．1基因敲除(

3、Cav．1斗)小鼠，采用新鲜制备的脂质体介导的基因转染法，将WTCav．1和Y14FCav．IcDNA转染到Cav．1基因敲除小鼠体内，使肺组织重新表达Cav．1蛋白(WTCav．1或者Y14FCav．1)。然后利用LPS致小鼠急性肿损伤模型，研究LPS诱导的Cav．1磷酸化在急性肺损伤形成过程中的作用。免疫印迹法检测Cav．1和磷酸化Cav．1的蛋白表达。ELISA法检测血浆中IL．6和TNF．C【的浓度。测量肺的湿干重比，判断肺水肿程度。另取Cav．1敲除小鼠36只，分为3组(n=12)：Con

4、trol组，wT组(WT)和Y14F组(Y14F)，分别转染空白质粒，wTCav．1cDNA和Y14FCav．1cDNA。转染成功后，对小鼠腹腔注射致死剂量LPS(20mg／kg)，观察96小时内两组小鼠存活率的差别。结果体外实验证明，LPS刺激能够引起Cav．1的快速的磷酸化，而且这种磷酸化是Src依赖性的。通过使用稳定转染TLR4．MD2一CDl4的HEK．293细胞系和徐州医学院硕士学位论文Cav．1敲除小鼠的肺内皮细胞，我们有力的证明了LPS所诱发的Cav．1的磷酸化能够增加C．aV．1和T

5、LR4之间的相互作用以及接下来的TLR4与MyD88之问的相互作用，从而最终导致了NF．KB的激活以及促炎症因子的产生。在体内实验中，通过使用基因技术．我们发现与转染野生型的Cav．1cDNA相比，往Cav．1基因敲除小鼠体内转染入不能磷酸化的Cav．1cDNA(Y14F)更能抵抗LPS的侵袭。这证明Caveolin．1的磷酸化是内毒素致急性肺损伤病理机制中重要的因素，结论Cav．1的磷酸化促进了TLR4信号传导，增强了了炎症反应，加重了内毒素致小鼠急性肺损伤的程度。关键词Caveolin．1；内毒

6、素；急性肺损伤；磷酸化；Toll样受体4徐妙】医学院硕士学位论文——————————————————————一———————一———————一——————————————————————————————————————一TheroleofphosphOrylationofCaveolin一1inLPS-inducedacutelunginjuryinmiceAbstractObjectiveToinvestigatetheroleofphosphorylationofCaveolin。1inLPS-

7、inducedacutelunginjuryinmice．MethodsBothTI_。R4．MD2．．CD14transfectedHEK．293celllineandCaveolin一1knockoutmouselungenclothelialcellswereusedinourexperiments．ThebothcelllinesweretransfectedwithWTCav-1cDNAOI。non-phosphorylated(Y14F)Cav-1cDNA．Aftertransfecti

8、on，thecellswerestimulatedbyLPStoobservetheroleofphosphorylationofCav-1onLPS-TLR4signalpathway．WesternblotwasperformedtoexaminetheproteinlevelofCar-1andthephosphorylationofbothCav一1andSrc．DegradationofIKB．12andactivationofNF。K：Bwerealsoa