1-磷酸鞘氨醇抑制c2-神经酰胺诱导小鼠早期胚胎凋亡的作用机制

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文1．磷酸鞘氨醇抑制C2．神经酰胺诱导小鼠早期胚胎凋亡的作用机制一hmechanismofsphingosine．1．phosphateinhibitsIeinhibitsn--C2--ceramide--inducedapoptosisofmurinepreimplantationembryos课题来源：国家自然科学基金(编号：30872769)学位申请导师姓专业名培养类培养层所在学人耿旭景名全松教授称妇产科学型专业型次硕士研究生院第一临床医学院2013年5月20日广州硕士学位论文1．磷酸鞘氨醇抑制C2．神经酰胺诱导小鼠早期胚胎凋

2、亡的作用机制硕士研究生：耿旭景指导教师：全松教授李红副主任医师摘要【研究背景】细胞凋亡参与卵母细胞受精障碍、胚胎发育停滞，从而导致体外受精．胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer，IVF．ET)失败。因而，抗凋亡干预胚胎发育过程可能成为改善胚胎发育潜能、提高胚胎质量和IVF．ET成功率的潜在途径。研究发现体外培养的人类植入前胚胎中大约有75％的胚胎存在不同程度的细胞内碎片和不对称性，其中大约50％的胚胎在第一周内停止发育。然而导致胚胎丢失的原因尚不清楚，可能包括染色体异常，培养条件欠佳或卵母细胞成熟障碍。也有研究发现发

3、育停滞的胚胎及碎片多的胚胎中细胞凋亡发生比率增高。因而，本研究通过在胚胎体外培养基中添加抗凋亡因子以期降低细胞凋亡程度、提高胚胎质量。鞘脂类是细胞膜上普遍存在的一种成分，其代谢产物1．磷酸鞘氨醇(sphingosine—l-phosphate，SIP)既可通过胞外受体途径又可作为胞内第二信使发挥着重要的生理学功能，如调控细胞存活、生长、增殖和凋亡。SIP不但可以抑制辐射、热刺激等诱发的卵巢、卵母细胞以及男性生殖发生细胞凋亡，而且外源性S1P可减少早期胚胎细胞凋亡从而改善胚胎发育潜能。大部分鞘脂代谢产物是具有生物活性的，其中神经酰胺(ceramide，Cer)和鞘氨

4、醇(sphingosine，Sph)是细胞凋亡的激活因子，而1．磷酸鞘氨醇(SIP)能够促进细胞存活和增殖，应激因子激活鞘磷脂酶产生神经酰胺，促进细胞凋亡；存活因子激活鞘氨摘要醇激酶l(sphingosinekinase，SphKl)致S1P增加而抑制Cer诱导的细胞凋亡作用。细胞内SIP和Cer间的动态平衡构成了“鞘磷脂变阻器(sphingolipidrheostat)”，因S1P和Cer发挥相反的生物学效应，且在细胞内可相互转化，S1P／Cer的比值变化可导致“sphingolipidrheostat'’失衡，而SIP和Cer间的动态平衡是决定细胞命运的重要因

5、素。本课题前期研究发现，25nMSlP可提高体外培养小鼠早期胚胎的囊胚形成率并降低2．4细胞期胚胎阻滞率和有碎片的胚胎率，而50“MC2．神经酰胺(C2．ceramide，CED)即可显著降低体外培养小鼠胚胎的囊胚形成率并使得24细胞期阻滞胚胎率和有碎片的胚胎率增加(与空白对照组比较)。因此，本研究通过在体外胚胎培养基添加25nMSlP和501aMCED，追踪观察小鼠胚胎体外发育情况，采用TUNEL、CASPASE原位荧光细胞凋亡检测技术检测小鼠早期胚胎细胞凋亡情况，探讨SIP能否抑制CED诱导的胚胎细胞凋亡、提高胚胎发育潜能。全基因表达谱芯片技术作为基因组学研究

6、的工具，可同时监测大量基因在胚胎不同发育时期的表达变化，从而成为研究发育相关基因的有效工具。利用芯片技术已经对小鼠植入前胚胎发育、小鼠小脑发育等过程基因表达进行了研究。故本研究采用全基因表达谱芯片技术分别分析CED、CED和S1P同时处理后小鼠早期胚胎中基因表达谱变化情况，分析参与CED促进胚胎细胞凋亡和S1P抑制胚胎细胞凋亡过程中的信号转导通路及参与凋亡通路的相关基因。肿瘤抑制基因p53调控细胞周期进程、DNA修复和细胞凋亡等细胞内生物学过程。p53基因也能够通过诱导不同促凋亡基因表达激活死亡受体和线粒体凋亡通路。早期研究发现在肿瘤应激反应中，p53作为神经酰胺

7、作用的下游靶点。而且在神经酰胺诱导的SKN．SH细胞凋亡过程中发现p53调控Bcl．2／Bax比例和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinylaspartate．specificprotease，caspase)表达馓活比例。因此，本研究中采用荧光定量PCR技术检测凋亡基因p53在小鼠早期胚胎中的表达情况，探讨S1P抑制早期胚胎凋亡的可能机制，为S1P抗凋亡干预改善胚胎发育技术应用于体外受精．胚胎移植临床治疗提供lI硕士学位论文实验依据。第一部分1．磷酸鞘氨醇、c2．神经酰胺对小鼠两细胞期胚胎基因表达谱的影响【目的】通过分析C2．神经酰胺(CED)、C2一神

8、经酰胺和1