转tierf1基因油菜的获得及分子检测

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1、ProductionandMolecularDetectionofTiERFlTransgenicRapeseedsbyLIUQianAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofSciencelnGeneticsinCentralSouthUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChangshaHunan410004，P．R．CHINASupervisor

2、ProfessorWANGAiyunMay,2014中南林业科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：囟荔加f￥年亏月2f日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关

3、部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：1、保密口，在——年解密后适用本授权书。2、不保密玑(请您在以上相应方框打“√")作者签名：善f殇导师签名：谚嗳弓印心年孑月z5ElⅥL毕年，月涉El摘要油菜是我国重要的油料作物。近年来，由核盘菌所引起的油菜菌核病已成为严重影响油菜生产。推广和选育抗菌核病油菜品种是控制该病害最安全、经济和有效的措施。然而，目前缺乏有效的抗菌核病油菜品种，基因工程技术为

4、油菜抗抗菌核病育种提供了一条新途径。本研究利用已有的单子叶植物表达载体pA20．TiERFl，构建双子叶植物表达载体pBIl21．TiERFl，在建立油菜再生体系及遗传转化体系的基础上，采用农杆菌介导法，将TiERFl基因转入甘蓝型油菜湘油15号和中双9号中，获得了转基因油菜植株。主要结果如下：1．pBll21．TiERFl植物表达载体的构建根据TiERFl基因序列，使用primer5软件设计引物，并加入BamHI和SacI酶切位点，采用PCR扩增TiERFl基因，并将其连接到pEASY-T1载体上进行测序。测序结果表明：扩增片段与原有TiERFl序列完全一

5、致，没有发生错配。将pEASY-T1．TiERFl载体和pBll21载体分别用BamHI和SacI双酶切，将得到的TiERFl片段与pBll21载体片段连接，构建表达载体pBIl21．TiERFl。通过冻融法将其转化农杆菌LBA4404，并进行菌落PCR检测。2．中双9号再生体系的建立在所筛选的生长素浓度配比中，中双9号最佳预培养基为MS+I．0mg／L6．BA+1．0mg／L2．4一D，最佳分化培养基为MS+3．0mg／L6-BA+0．02mg／LNAA“．5mg／LAgN03，再生率为92．5％。3．中双9号和湘油15号遗传体系的优化通过单因素对农杆菌转

6、化效果的研究表明：湘油15号对TiERFl基因最优转化条件为：选取5d茁龄的幼苗，预培养3d、菌液OD600为0．6，侵染5min，共培养2d，加入AS200I．tmol／L；中双9号对竹ERFI基因最优转化条件为：选取5d苗龄的幼苗，预培养3d、菌液OD600值0．4，侵染5min，共培养2d，加入AS2009mol／L。4．中双9号和湘油15号再生植株的获得及分子检测在经过Kan严格筛选后获得湘油15号抗性植株8株，中双9号抗性植株9株。对再生植株进行PCR检测得到湘油15号阳性植株4株，中双9号阳性植株5株，分别占再生植株的50．00％和55．56％。

7、本研究获得了转TiERFl基因油菜。关键词：甘蓝型油菜；TiERFl基因；农杆菌介导法；PCRIIAbstractRapeseedisanimportantoilseedcropinChina．Thediseaserapesclerotiniarot，mainlycausedbySclerotiniasclerotiorum，hasbecomeoneofthemostseriousdiseasesofrapeseedinChinaandseriouslychallengingthequantityandqualityofrapeseedproductioni

8、nrecentyears．Themostsafety