白花丹参对缺血再灌注致脑损伤保护作用的研究

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1、泰山医学院硕士学位论文白花丹参对缺血再灌注致脑损伤保护作用的研究姓名：王晓哲申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：白波;张秋玲20090501白花丹参对缺血再灌注致脑损伤保护作用的研究研究生：王晓哲专业：神经生物学指导教师：白波教授张秋玲副教授中文摘要目的观察白花丹参对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑微循环及脑细胞的影响，探讨它在脑缺血再灌注后对脑组织的保护作用及其可能的机制，为白花丹参用于缺血性脑血管病的治疗提供实验依据。方法1．动物模型制备：采用大脑中动脉栓塞法(middlecerebralarteryocclusion

2、，MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。2．实验动物分组：健康成年SPF级SD大鼠，雌雄不限，随机分为实验对照组(shamoperationcontrol，sham)、脑缺血再灌注组(ischemia／reperfusion，I／R)和脑缺血再灌注+白花丹参干预组(ischemia／reperfusion+$alviamiltiorrhizabge．，alba，I／R+Sal．)。3．白花丹参提取物的制备：将白花丹参(Salviamiltiorrhizabge．f．alba,Sal．)粉碎后，参照药典规定的常规方法制备白

3、花丹参粗制剂。4．给药方法：取I／R+Sal．组大鼠，参考紫花丹参的用药剂量，于脑缺血再灌注术后30min灌胃给药，每天1次，用至取材时间，在最后一次给药后30min取材。．5．超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)的检测：制备脑匀浆，参照南京建成生物技术有限公司提供的方法进行反应，利用比色法在550nm处检测OD值，根据公式计算SOD的活性。6．丙二醛(malondialdehyde，MDA)的检测：制备脑匀浆，参照南京建成生物技术有限公司提供的方法进行反应，利用比色法在532nm处检测OD值，根

4、据公式计算MDA的含量。7．微量Na+一K+ATP酶(Na+一K+．ATPase)的检测：制备脑匀浆，按照试剂盒提供的操作步骤进行酶促反应，在636nm波长处测定各管OD值，根据1公式计算ATPase活力。8．内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)蛋白的表达：石蜡切片，免疫组织化学染色，显微镜下观察eNOS的表达。9．基质金属蛋白酶．9(matrixmetalloproteinase．9，MMP．9)蛋白的表达：石蜡切片，免疫组织化学染色，显微镜下观察MMP．9的表达。1

5、0．内皮抑素(endostatin，ES)蛋白的表达：石蜡切片，荧光免疫组织化学染色，激光共聚焦显微镜下观察ES的表达。11．脑血流量(cerebralbloodflow,CBF)的检测：激光多普勒血流仪(1aserflowmetry,LDF)检测各组术后3d大鼠海马CAI区CBF占术前基础CBF的百分比。12．脑缺血再灌注后脑细胞线粒体跨膜电位(mitochondrialtransmembranepotential，一般用△’王，m表示)的测定：制备脑组织单细胞悬液，罗丹明123(rhodanminel23，Rhl23)染

6、色，流式细胞仪(flowcytometry,FCM)检测细胞内荧光强度，分析△甲m的变化。13．半胱氨酸天冬酶-3(cysteine—aspirateprotease-3，Caspase-3)蛋白的表达：石蜡切片，荧光免疫组织化学染色，激光共聚焦显微镜下观察Caspase．3的表达。14．脑缺血再灌注后脑细胞凋亡发生率(theincidenceofapoptosis)的测定：制备单细胞悬液，进行AnnexinV．FITC+PI双染，通过FCM检测细胞内荧光强度，分析脑组织凋亡发生率的变化。结果1．I／R组与sham组比较：脑

7、缺血再灌注后脑组织SOD活力明显降低(尸<0．01)；MDA含量明显升高(P<0．01)；脑组织微量Na+．K+．ATP酶的活性明显降低(P<0．01)：eNOS表达明显升高(P<0．01)；MMP．9表达明显上调(尸

8、+鼬正组与I／R组比较：脑组织SOD活力于脑缺血再灌注3h时上调(尸<0．05)，于再灌注l2h、24h、48h时明显上调(P<0．01)；脑组织MDA2含量于再灌注12h和48h时下降(P