球孢白僵菌的退化与dna甲基化关系的初步研究

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1、分类号：Q939.9单位代码：10364密级：学号：11720416安徽农业大学学位论文球孢白僵菌的退化与DNA甲基化关系的初步研究PreliminarystudyontherelationshipbetweendegradationofBeauveriabassianaandDNAmethylation研究生：汪超指导教师：黄勃教授合作指导教师：申请学位门类级别：理学硕士专业名称：微生物学研究方向：分子生物学所在学院：生命科学学院答辩委员会主席：二零一四年六月万方数据独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及

2、取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国

3、学位论文全文数据库》，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）。学位论文作者签名：指导教师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通信地址：邮编：万方数据球孢白僵菌的退化与DNA甲基化关系的初步研究摘要球孢白僵菌Beauveriabassiana（以下简称白僵菌）具有侵染力强、分布广以及流行快的特点；同时也具有易于培养，不污染环境等优势。因此，作为重要的昆虫病原真菌，白僵菌目前已广泛应用于农林业害虫生物防治。然而，在实验室

4、培养和工业生产过程中，白僵菌也普遍存在着菌体退化问题。白僵菌菌体退化对于其发酵生产及杀虫效果有着直接的负面影响。研究表明，DNA甲基化修饰普遍存在于生物生命过程中。它通过调节基因表达使生物体在生长发育过程中产生出不同的性状。因此，揭示球孢白僵菌在培养过程中菌体退化与其DNA甲基化的关系，可以为今后进一步研究白僵菌表观遗传学以及DNA甲基化在菌体生长发育机制中的具体功能提供基础材料和科学依据，同时也将为白僵菌的规模化发酵与产业化奠定更加坚实的理论基础。本研究采用RACE技术克隆出球孢白僵菌DNA甲基转移酶编码基因Dim-2全序列，并通过

5、生物信息学方法，对该蛋白进行了同源序列比对与系统发育树分析。同时，本研究还利用Realtime-PCR技术和HPLC技术对球孢白僵菌在生长发育过程中Dim-2基因的转录表达以及基因组DNA中5-甲基胞嘧啶的含量进行了检测，分析了球孢白僵菌生长发育过程中DNA甲基化的变化情况。序列分析表明，球孢白僵菌Dim-2基因cDNA序列全长为4021bp，编码了1142个氨基酸。其5’非翻译区（5’-UTR）与3’非翻译区（3’-UTR）分别为283个核苷酸和303个核苷酸。预测的白僵菌DIM-2编码蛋白分子量为128kD，理论等电点6.13。利

6、用NCBI提供的蛋白保守区数据库（CDD）平台对球孢白僵菌Dim-2基因编码蛋白保守结构域进行预测。结果显示，该蛋白含有能催化合成5-甲基胞嘧啶的活性区域以及一个BAH结构域。蛋白多序列比对与进化树分析显示，球孢白僵菌Dim-2基因编码蛋白与GenBank中已登录注释的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)、轮枝菌（Verticilliumalboatrum）、粗糙脉孢霉（Neurosporacrassa）、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)等11种真菌的DNA甲基转移酶具有高度同源性。包括

7、白僵菌DIM-2编码蛋白在内的12种真菌DNA甲基转移酶氨基酸序列共聚成两个群。其中与球孢白僵菌Dim-2基因编码蛋白关系最近的蛹虫草DIM-2蛋白，二者一致性达到了63%。将本实验室保存的球孢白僵菌Bb2005单孢株点接于SDAY培养基中，25℃下每十天传代培养一次，并观察菌体生长与产孢情况。菌落形态学检测发现，在1~3代时，白僵菌Bb2005菌落呈规则的圆形，5天后开始产孢，第7天形成大量孢子；而第4代培养时，菌体开始出现不规则的扇形角变区域，且产孢变少；培养至第10代时出现菌丝生长旺盛，产孢明显减少的状态；而培养至第25代时白僵

8、菌Bb2005已完全I万方数据退化，菌丝疯长且很少产孢。利用Realtime-PCR与HPLC技术分别对第1代、第25代和复壮后的球孢白僵菌Bb2005菌株在第3、5、7、10、15天培养时的Dim-2基因转录表达量和基