猪圆环病毒ⅱ型orf4表达缺失株的构建及其功能地地研究

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1、ZHEJIANGSCI．TECHUNIVERSITYMASTERDISSERTATIONConstructionandfunctionanalysisofORF4--deficientporcinecircovirustype2ZhangzhaoGaoYonghouJiangCollegeofLifeSciences，ZhejiangSci·TechUniversityDecember,2012HANGZHOU，CHINA分类号：UDC：密级：猪圆环病毒II型ORF4表达缺失株的构建及其功能研究论文答辩日期弘f；、雩．、7答辩委员会主席江双论文评阅人宣垒盎答辩委员会成员垒竭垃生塑睦篁兰瑟

2、、2‘【刁弋浙江理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位做作者繇岛鸯暖日期：y哆年乡月加日浙江理工大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容

3、编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口，在不保密囹。学位论文储繇辫!匠日期：如哆年；月『々日年解密后使用本版权书。指导教师繇喜茅序日期：加谚年每月10B课题来源浙江省自然科学基金(Y3090166)浙江理工大学硕士学位论文猪圆环病毒II型ORF4表达缺失株的构建及其功能研究摘要目的猪圆环病毒II型(PCV2)作为断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，对养猪业造成重大经济损失。同时，PCV2可能存在人畜共患病原的潜在威胁，但PCV2的致病机制目前仍不十分清楚。在PCV2分子致病机理研究中，已有3个开放阅读框(ORFs)

4、的功能得到验证：ORFl表达Rep和Rep’两个复制相关蛋白，参与病毒复制；ORF2表达病毒蛋白外壳；ORF3编码蛋白参与病毒介导的细胞凋亡。ORF4重叠于ORF3内，其对于病毒致病机制的功能尚不清楚。本研究通过构建PCV2ORF4表达缺失突变病毒，研究该蛋白于病毒复制和介导细胞凋亡的作用。同时，在本课题组前期工作确定ORF3／ORF4发生转录并获得相关3’poly(A)加尾位点的基础上，对ORF3／ORF4转录产物的5’端起始位点进行确认，为ORF4基因功能研究奠定基础，为研究PCV2致病机理提供新的研究方法和理论依据。方法首先，在课题组已获得PCV2基因组全长序列的基础上，对序列进行

5、分析，选择病毒突变位点。通过起始密码子突变和引入无义突变使突变后的阅读框转录产物在蛋白翻译过程中提前终止，从而无法产生有效蛋白。依据PCR定点突变试剂盒原理构建突变体质粒，经酶切回收病毒基因组片段，在自环化反应后转染PK．15宿主细胞以产生突变病毒。产生的病毒通过检测体外复制能力、RNA剪接和外壳蛋白的形成，最终确定重组及突变病毒的完整性和感染力。构建了荧光定量检测体系，并利用该体系检测等拷贝数野生型、重组野生型和突变型病毒感染细胞后病毒DNA拷贝数和ORFl、ORF3、ORF4mRNA表达量差异，分析ORF4蛋白缺失对病毒复制的影响。在病毒感染细胞凋亡分析中，通过caspase家族活性

6、检测，检测重组野生型和突变型病毒在病毒介导细胞凋亡功能上的差异。最后，利用5’RACE技术对ORF4基因mRNA5’末端转录起始位点进行鉴定。结果(1)成功构建了具有体外感染能力的重组野生型和突变型病毒，并且突变病毒的突变位点在连续传代第十五代病毒中仍然存在。(2)成功构建了可用于病毒滴度及多个ORFmRNA表达量测定的荧光定量检测体系，定量范围为2．53x102-2．53x107拷贝数之间(R2>O．99)。(3)通过检测等滴度野生型、重组野生型和突变型病毒感染细胞后病毒拷贝数和mRNA表达量上的变化，发现ORF4与病毒复制能力无关。同时各mRNA表达量检测中发现，ORF4蛋白缺失不影

7、响ORF4mRNA表达。ORF4蛋白的缺失提高了ORF3的mRNA表达水平而参与病毒介导的细胞凋亡。同时，该蛋白缺失使病毒在感染周期中有更高效的复制活性，表现为ORFl的高表达。(4)检测了重组野生型和突变型病毒在介导细胞凋亡的作用，发现ORF4缺失使病毒介导细胞凋亡能力提高。(5)通过5’RACE技术检T浙江理工大学硕士学位论文猪圆环病毒II型ORF4表达缺失株的构建及其功能研究测到一个nt593位置的5’端位点，并通过PCR方法