海水养殖中常见病原菌冻干保护剂配方与冻干工艺研究

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1、分类号——————————————————————密级UDC研究生学位论文海水养殖中常见病原菌冻干保护剂配方与冻干工艺研究研究生姓名于永翔指导教师姓名战文斌教授王印庚研究员申请学位级别硕士专业名称水生生物学论文答辩日期2014年5月30日学位授予日期2014年6月中国海洋大学万方数据仅以此文献给养育我的父母和尊敬的导师以及关心、支持和帮助我的朋友们-------于永翔万方数据海水养殖中常见病原菌冻干保护剂配方与冻干工艺研究学位论文答辩日期：年月日指导教师签字：答辩委员会成员签字：万方数据独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文

2、中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日--------------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以

3、将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据海水养殖中常见病原菌冻干保护剂配方与冻干工艺研究摘要长期保存海水养殖病原菌的活性是深入进行其病原学研究的重要前提和保障。真空冷冻干燥技术是目前情况下制备和保藏生物材料最有效的方法之一。本文初步探讨了真空冷冻干燥技术在5株海水养殖重要致病菌菌种保藏中的应用，相关的研究成果

4、将为海洋细菌真空冷冻干燥工艺研究提供重要的参考和借鉴。1.病原微生物冷冻干燥保护剂的筛选实验选取迟钝爱德华氏菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌等5株3属的病原细菌为实验菌株，以不同浓度的脱脂乳、海藻糖、甘露醇、乳糖、果糖、葡萄糖、抗坏血酸和明胶等八种物质作为冻干保护剂，以添加等体积1.50%氯化钠溶液为对照。结果表明：以不同浓度的抗坏血酸和明胶为冻干保护剂的实验组中均未检测到活菌的存在；与对照组相比，一定浓度的脱脂乳和糖类均可在冷冻干燥过程中对病原菌起到保护作用，各保护剂对菌株的冻干保护效果由强到弱依次为：假交替单胞菌：脱脂乳，麦芽糖，海藻糖，乳糖，甘露醇，葡萄糖，果糖；

5、迟钝爱德华菌：脱脂乳，乳糖，甘露醇，海藻糖，麦芽糖，葡萄糖，果糖；哈维氏弧菌：甘露醇，海藻糖，乳糖，麦芽糖，果糖，脱脂乳，葡萄糖；鳗弧菌：乳糖，甘露醇，脱脂乳，麦芽糖，海藻糖，葡萄糖，果糖；灿烂弧菌：甘露醇，乳糖，脱脂乳，海藻糖。2.冷冻干燥保护剂配伍优化根据单因素筛选的实验结果，本章选取脱脂乳、乳糖、海藻糖和甘露醇为冻干保护剂，同时添加了一定量的抗坏血酸作为抗氧化剂，明胶作为赋形剂来进行保护剂的正交复配实验。结果表明，假交替单胞菌、迟钝爱德华氏菌和哈维氏弧菌通过正交分析得到了最佳的保护剂配比，并且通过三次重复验证实验可证明复配保护剂的稳定性较好。其中假交替单胞菌的最佳保护剂配比和对

6、应的细胞存活率为：乳糖7.5%、甘露醇5%、海藻糖5%、脱脂乳10%、Vc0.5%、明胶0.5%，3次重复检验细胞存活率均大于32.17%；迟钝爱德华氏菌为：5%的乳糖、15%I万方数据的脱脂乳、0.5%明胶、0.5%的Vc，3次验证后保护剂的稳定性较好，细胞存活率在20.0%左右。哈维氏弧菌的最佳保护剂配比为：7.5%的乳糖、5%的甘露醇、5%的海藻糖、15%的脱脂乳、0.5%的明胶和0.5%的Vc，验证实验中细胞存活率均在5.0%左右。鳗弧菌和灿烂弧菌因冻干后的细胞复活率极低，各正交实验组之间差异不明显，未获得保护效果明显的保护剂配比。上述结果表明弧菌类的菌株与假交替单胞菌和迟钝

7、爱德华氏菌相比，其冻干保护效果较差。3.真空冷冻干燥条件与工艺优化以假交替单胞菌为代表菌株，以经复配并验证的假交替单胞菌复配保护剂为冻干保护剂，主要对冻干保存过程中保护剂含盐量，复水介质，初始细菌浓度，保护剂与菌液的比例，细菌生长阶段等工艺条件进行探讨。结果表明：当以1.5%NaCl溶液制备菌悬液时，保护剂的最佳含盐量为0.5%，此时细菌的存活率9为40.3%；初始细胞浓度的最适范围在1-5×10CFU/ml之间，细胞浓度过高或过低都会降低细胞存活率；5-