rna干扰对小鼠pcdh18基因抑制的体外研究初探

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1、学位论文RNA干扰对小鼠Pcdhl8基因抑制的体外研究初探PreliminarystudyofRNAInterferenceontheExpressionofmPcdhl8GeneinVitro研究生：莫依梦学科：动物学导师：薛整风研究员本研究由国家自然科学基金(31201864)资助莫依梦：RNA干扰对小鼠Pcdhl8基因抑制的体外研究初探RNA干扰对小鼠Pcdhl8基因抑制的体外研究初探研究生：莫依梦导师：薛整风研究员中文摘要原钙黏附蛋f刍(Protoeadherin，Pcdh)是一类钙离子依赖的细胞黏附分子，组成了经典钙黏蛋白家族中最大的子家族。研究表明，原钙黏蛋白在哺乳动物早期胚胎

2、发育过程的组织形态发生和形成方面起着重要作用，在动物出生后的脑组织中，原钙黏蛋白则主要调节神经突触的传导和特定突触连接的形成。Pcdhl8是原钙黏蛋白62亚家族中的成员，报道指出Pcdhl8基因抑制可致斑马鱼神经系统发育异常并呈剂量依赖性胚胎死亡，该结果可为人类Pcdhl8基因功能确定提供线索。但是，斑马鱼与人类Pcdhl8仅有66％的序列同源性，且结构也不尽相同，若要获得更为可靠的参考，须以哺乳动物为对象做进一步研究。研究基因功能最常用的方法是构建基因敲除小鼠，而Pcdhl8极有可能是必须基因，基因敲除可因神经系统发育缺陷导致胚胎死亡，因此获得Pcdhl8基因敲除小鼠的前景不容乐观。RN

3、A干扰(RNAi)是一种由小干扰RNA(siRNA)所引发的转录后基因沉默。将RNA干扰理论与转基因小鼠技术相结合，通过控制基因抑制效率可获得Pcdhl8恰当“下调”而非完全“敲除”的I矾Ai小鼠，既可规避胚胎死亡，又可获得缺陷表型进而倒推基因功能。本研究旨在通过体外细胞培养，筛选出能高效抑制小鼠Pcdhl8基因表达的siRNA序列，为获得RNAi小鼠提供合适的高效siRNA，实验分以下三个方面进行。1．融合表达载体pEGFP—mPcdhl8的构建和鉴定利用RT-PCR技术自14．5ddx鼠胚胎中扩增mPcdhl8基因片段(缺终止密码子)并进行测序鉴定；将扩增片段定向克隆入载体pEGFP-

4、N1，使其同框融合于EGFP报告基因N．端，通过酶切鉴定筛选出mPcdhl8、EGFP融合表达载体pEGFP．mPcdhl8。pEGFP．mPcdhl8转染小鼠成纤维细胞NIH／3T3和人胚肾细胞293T，通过荧光显微镜观察、RT-PCR检测mPcdhl8基因的融合表达。结果显示，成功构建融合表达载体pEGFP．mPcdhl8，且其主要在细胞质中表达并呈点状分布，在细胞与细胞的连接处表达量高，该结果为进一步研究Pcdhl8的基因功能提供了细胞水平上的依据，所构建的融合表达载体可用于后续的RNA干扰研究。II一扬州大学硕士学位论文2．真核表达载体pcDNA3．1(+)一mPcdhl8的构建和

5、表达将扩增片段定向克隆入载体pcDNA3．1(+)，通过酶切鉴定筛选出真核表达载体pcDNA3．1(+)．mPcdhl8。将其转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS．7中，通过间接免疫荧光检测、细胞免疫组化方法以及RT-PCR检狈lJmPcdhl8基因的表达情况。结果显示成功构建真核表达载体pcDNA3．1．mPcdhl8，并通过转染COS．7细胞再次证实了Pcdhl8在细胞质中的表达，同时所构建的真核表达系统为进一步研究Pcdhl8的蛋白表达情况及其介导的细胞黏附功能提供了实验材料。3．siRNA序列预测分析以及高效抑制mPcdhl8融合表达的siRNA序列筛选针对mPcdhl8基因的保守序列

6、，设计并体外化学合成了4对特异性干扰mPcdhl8表达的siRNA。将融合表达载体pEGFP．mPcdhl8与siRNA片段共转染人胚肾细胞293T，通过荧光显微镜观察、流式细胞术等检测siRNA对mPcdhl8基因表达的抑制效果，筛选出抑制效率达80％以上的siRNA序列。结果显示，与阴性对照的序列非特异一

7、生siRNA(siRNA．negativel相比，所设计的siRNA中有三对片段Pcdhl8．mUS．975，Pcdhl8-mus．1850和Pcdhl8．mus．2579均能在转染后24～72h内有效抑制外源mPcdhl8基因的表达，抑制率可达到90％以上，说明该实验设计的siRN

8、A靶点是有效的。这为今后获得针对mPcdhl8的RNA干扰小鼠，进一步研究mPcdhl8基因的功能奠定了基础。综上所述，本研究成功构建了融合表达载体pEGFP．mPcdhl8和真核表达载体pcDNA3．1(+)．mPcdhl8，并通过体外细胞培养筛选出高效抑$0mPcdhl8基因表达的siRNA序列，在细胞水平上初步探索了Pcdhl8的表达和功能，为进一步研究Pcdhl8的基因功能提供了良好的工具。关键词：mPcdhl8