酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用

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1、酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用摘要目的：研究免疫增强活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯(SPS)的修饰条件。方法：通过L9(3)4正交设计对氯磺酸-吡啶法制备SPS的工艺进行优化，并以MTT法测定其对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的促进作用。结果：最佳修饰条件为氯磺酸∶吡啶=1∶6（V/V），反应温度70℃，反应时间3h，硫酸基取代度可达1.092。在50～200μg·mL-1内，最佳工艺所得SPS对小鼠脾淋巴细胞生长有显著促进作用，平均增殖率可达89.85%。结论：优化方法制备的SPS对小鼠脾淋巴细胞生长具有显

2、著的促进作用。关键词葡聚糖；酵母；氯磺酸-吡啶法；淋巴细胞我国的酵母资源十分丰富，年产啤酒沉淀酵母泥3～5万吨(干基)，目前该资源仅作为饲料廉价销售或直接作为废物排入下水道，既造成环境污染又造成资源浪费[1]。酵母细胞壁是生物活性较强的β-1,3-D-葡聚糖的重要来源之一，其中碱不溶性β-1,3-D-葡聚糖占85%[2]。由于其分子量大，在水中溶解性差，使其在应用上受到很大限制。利用现代生物技术对酵母废泥进行充分开发利用，使其中β-1,3-葡聚糖得以综合利用，将大力推动医药产业的发展。多糖硫酸酯化修饰后由于所带硫酸基团的空

3、间位阻和静电排斥效应改变了原来的空间结构，增加了糖链的屈伸度，提高了水溶性，从而引起生物活性的改进与改变[3]。现今多用氯磺酸-吡啶（Wolfrom）法进行改良，借以达到不同的修饰目的[4-6]。本研究通过控制酯化试剂比例、反应时间、反应温度，开展酯化工艺的研究，以制备免疫活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯（SPS）。1仪器与药材冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（Thermo）；酶标仪（Bio-Tek）；倒置显微镜（Olympus）；透析袋（南京都莱生物技术有限公司）；96孔培养板(Costar)。酵母葡聚

4、糖（纯度90%，本校微生物学教研室提供）；无水吡啶、无水二甲基亚砜（DMSO）、刀豆蛋白（ConA）为Sigma产品；RPMI1640培养基、新生小牛血清为Gibco产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）为Amresco产品；其它试剂均为分析纯。清洁II级雄性ICR小鼠，体重(20±2)g；中国药科大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(苏)2008-0010。2方法2.1酵母葡聚糖的硫酸酯化将吡啶加入附有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶中，置于冰盐浴，逐滴加入氯磺酸，10min滴加完毕。再加入酵母葡聚糖20mg，立即将其移入预热的油

5、浴中于40～100℃恒温反应。反应完毕后，将反应液倾入冰水中，以10mol·L-1NaOH调至pH中性，以去离子水透析48h，透析液浓缩醇沉、复溶、冻干，即得SPS，得率80.78%。2.2SPS对小鼠淋巴细胞生长的影响[7]将小鼠脱颈处死，取脾脏，去外周结缔组织，并用不含血清的RPMI1640培养液清洗脾脏，以匀浆器研磨脾脏成单个脾细胞，200目的尼龙筛网滤过，以红细胞裂解液1000r·min-1离心洗涤细胞两次，以培养基洗涤一次，最后以含10%小牛血清的RPMI1640培养液悬浮细胞，置37℃恒温、5%CO2孵箱中孵育

6、4～6h，除去贴壁的巨噬细胞，悬浮的即为小鼠脾淋巴细胞。以培养基调整小鼠脾淋巴细胞浓度至5×106/L，于96孔板每孔加100μL细胞悬液，再加入含SPS培养液（终浓度分别为50、100、200μg·mL-1），每孔终体积为200μL，同时设定空白对照和阳性对照（ConA，终浓度7.5μg·mL-1）。每浓度设4个复孔，置37℃、5%CO2培养44h后，每孔加入MTT（5mg·mL-1）20μL，继续培养4h，3000r·min-1离心20min，弃上清液，每孔加入DMSO100μL，混匀，酶标仪570nm处检测吸光值。2

7、.3酵母葡聚糖硫酸酯化条件的优化[8]以免疫细胞的增殖率为响应值，采用3因素3水平的正交实验L9(34)对试剂比例、反应温度和反应时间进行正交试验优化。正交实验方案及结果列于表1中。2.4硫酸根含量的测定及取代度的换算[9]采用氯化钡-明胶比浊法测定多糖样品中的硫酸根含量。分别吸取浓度为1.0mg·mL-1的硫酸钾标准品溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，各以1mol·L-1的盐酸溶液补至4mL，摇匀，分别加入3.5mL0.8%的三氯乙酸溶液，摇匀，再分别加入2.5mL氯化钡-明胶溶液（1.0gBaCl

8、2溶解于200mL的0.5%的明胶水溶液中），摇匀，室温下静置15～20min，以第一管为空白对照，测定360nm处吸光度。精密称定SPS10.0mg，置玻璃瓶中，加1mol·L-1盐酸溶液10mL，振摇至供试品全溶，于100℃水解6h。冷却后，过滤除去不溶物即得供试品溶液。取供试品溶液4mL两份，各加