hucb-mscs在大鼠视神经急性损伤中的抗凋亡与促进再生的实验研究

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1、第二军医大学硕士学位论文hUCB--MSCs在大鼠视神经急性损伤中的抗凋亡与促进再生的实验研究姓名：陈美兰申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：蔡季平201206hucB。Mscs在大鼠视神经急性损伤中的抗凋亡与促进再生的实验研究．中英文摘要hUCB—MSCs在大鼠视神经急性损伤中的抗凋亡与促进再生的实验研究摘要视神经损伤在临床很常见，很多眼科疾病都会导致视神经损伤，最终导致视力下降甚至失明，视网膜神经节细胞(retinaJg锄glioncells，RGCs)的逐渐死亡是视神经损伤后视觉障碍不可逆转的一个重要原因，目前

2、临床上尚无有效的治疗方法。与中枢神经系统损伤类似，视神经受损伤后，即有部分细胞坏死，残存的神经细胞因缺血、兴奋性神经递质释放、钙超载、炎症反应等继发性损伤而逐渐发生凋亡或死亡。经典理论认为成年哺乳动物的视神经损伤后是有再生反应，但却无再生能力。轴突损伤后，RGCs早期发生再生支芽，但不久就萎缩了，是“失败”的再生。最近一二十年的基础研究和动物实验证明只要给予适当的内外微环境，视神经轴突在损伤后是可以再生的，因此促进受损的RGCs修复和再生是目前眼科研究的一个热门话题。干细胞的发现为细胞替代治疗和促进神经修复带来了希望，但

3、以往胚胎干细胞和神经元干细胞的应用涉及伦理道德的限制而影响其的应用。目前应用最多的是间充质干细胞，间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多项分化能力、造血支持、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，并且在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为软骨、脂肪、骨、肌肉、神经等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，是组织工程研究中较为理想的种子细胞。近几年来间充质干细胞一直被用于脊髓、脑缺血损伤等中枢神经系统疾病的研究，研究显示间充质干细胞具有一定的神经保护作用。本研究拟建立SD

4、大鼠视神经急性钳夹损伤模型，并用人脐带血间充质干细胞(hum锄啪bilicalcordb100dmesenChymalstemcells，hUCB．MSCs)移植到大鼠的眼玻璃体腔内，探索hUCB．MSCs对大鼠急性视神经损伤的抗凋亡与促进神经再生的作用，为将来弥补现有临床治疗手段的不足奠定实验基础，这对神经眼科学的发展和眼科临床都有重要意义。本课题研究包括两部分，第一部分细胞实验(hUCB．MSCs的分离、纯化和鉴定)：采用密度梯度离心法和贴壁法从人脐带血中分离提纯间充质干细胞并鉴定。第二部分第二军医大学硕士学位论文动

5、物实验(玻璃体腔内移植hUCB．MSCs对大鼠急性视神经损伤的抗凋亡与促进神经再生作用)：将动物分为治疗组、对照组和正常组，用荧光金(FluorogoldFG)逆行示踪标记SD大鼠视神经急性损伤模型的RGCs并计数；苏木素．伊红(HE)染色观察视神经急性损伤后和问充质干细胞移植后视网膜的形态学变化；免疫荧光，WeStemBlotting和R．eal．nmePCR分析神经轴突中生长相关蛋白43(卿wtll弱sociatedprotein43，GAP43)蛋白的表达变化情况；免疫荧光和Real．TiHlePCR检测A1印配体

6、门控嘌呤受体P2x7蛋白的表达情况；免疫荧光检测促凋亡蛋白Ba)【和抑凋亡蛋白Bcl．2、半胱氨酸蛋白酶CaSpause．3蛋白的表达情况；1、mel原位检测细胞的凋亡水平等手段比较各组的差别。本研究的主要结果如下：1．hUCB—髑Cs体外分离纯化培养体外分离纯化的huCB—Mscs与文献报道一致：光镜下呈双极状态，两个突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞。流式细胞仪鉴定为：CDl3、CD29、CD44、CDl05、CD90呈现强阳性，而CD34、CD45，HLA．DR则表现为弱阳性，证实为间充质干细胞。2．SD大鼠大脑立

7、体定位荧光金逆行示踪标记RGcs并计数无论对照组还是治疗组RGCs数目都是随时间逐渐递减的，但同一时间点下治疗组的RGCs数目都要比对照组多(尸

8、14d较明显，之后急剧下降；hUCB．MSCs移植治疗组于第7d和14d时GAP-43表达明显增加并达峰值之后开始下降。WbStem检测结果显示无论是对照组还是治疗组GAP．43蛋白表达第3d时和正常组的差异不大，第7d、14d蛋白表达明显增高，但第14d蛋白水平比7d组的蛋白表达略少，开始下降。但治疗组每个时间点下