茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选及防御酶系的研究

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1、郑州大学硕士学位论文茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选及防御酶系的研究姓名：刘莉铭申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：田保明；刘红彦201205掺墨摘要芝麻(Sesamumindicum)原称为胡麻，是我国四大油料作物之一，芝麻生育期正处于高温多雨季节，这一时期有利于多种病害的发生，其中茎点枯病就是一种常见的病．：，它是由芝麻壳球孢(Macrophominaphaseolina(Tassi)Goid．)引起的一种真菌性病害，可以侵染芝麻根系或茎杆，从而引起整株或部分茎的枯萎。每年都因茎点枯病致使芝麻的品质和产

2、量受到严重影响，人们一般通过改变耕作方式或喷施药剂来解决这一问题，但前者效果并不是很好，而后者不仅增加各方面的投入而且对环境造成严重的危害，农药的富集最终还会影响人类的身体健康。要从根本上解决这一问题的方法就是培育抗病品种，所以加强相关抗病机理的研究，对抗病性的开发利用具有重要意义。本研究首先利用qRT-PCR技术筛选出茎点枯病菌诱导下在芝麻中表达较稳定的内参基因，再选取过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)4个基础防御酶作为研究对象，利用酶活测定技术和qRT-PCR

3、技术分别从蛋白和基因两个层面上分析它们在病程中变化情况，旨在了解它们与抗病性之间的关系。主要得出以下结果：l、内参基因的克隆和筛选用CodeHop方法设计简并引物克隆得到了GAPDH,fl-actin、a．tubulin、珊西、RPL4、elF4A和P删a7个看家基因的部分序列，将这7个基因和CrenBank中已公布的18SrRNA、NADHD2个基因共9个基因作为候选内参基因，利用实时荧光定量PCR技术，分析其在茎点枯病菌诱导下芝麻中的表达稳定性。经BestKeeper、NormFinder和GeNorm软件分析可知

4、，VSQS、elF4A、a．tubulin等3个基因表达均较稳定。2、四种防御酶酶活的测定利用常规酶活测定方法测定了4种酶的活性，各酶的变化趋势与芝麻植株的病情指数存在对应关系，说明他们应该直接参与了抗病反应过程。3、四种防御酶基因的克隆利用CodeHop设计简并引物、RT-PCR、RACE等技术对4个防御酶全长基因进行克隆，结果显示POD全长1990bp，氨基酸最高相似性100％；CAT全长1479bp，氨基酸最高相似性97％；SOD全长678bp，氨基酸最高相似性91％；I摘要即D全长1755bp，氨基酸最高相似性

5、44％。4、四种防御酶基因的表达分析利用定寰PCR技术对4种酶的基因在病程中的表达情况进行了分析，4个基因均呈诱导型表达。基因的表达趋势与酶活性的变化趋势在24h以前的早期抗病反应中存在较好的对应关系，并且与抗病反应发生的时间也存在对应关系，说明他们在芝麻抗茎点枯病原菌过程中有重要作用，但也有酶活变化相对于基因表达变化具有滞后性、基因表达水平和酶活水平相冲突的情况，可能与基因的翻译以及翻译后的加工调控有密切的关系。由研究可知，在茎点枯病菌侵染下对芝麻抗病相关基因进行表达分析时可优先选择珊分、elF4A、a-tubuli

6、n这三个表达较稳定的基因为内参基因。通过对四种防御酶进行研究，发现他们在基因表达水平和酶活水平上表现不一致，但参与了芝麻抗病反应过程。关键词：芝麻；茎点枯病菌；酶活；内参基因；qRT-PCR；ⅡAbstractAbstractSesame($esamumindicum．)，normallyknownasflax，isoneofthefourmajoroilcropsofChina．Sesamejustgrowinthehotandrainyseason,SOitalwayseasilyleadtoavarietyofd

7、iseases，ofwhichstemrotisacommondisease．mstemrotcan●，●causethewholeorthepartofsesamewiltbecauseoftheinfectionofMacrophominaphaseolina(Tassi)Ooid．Generallyitcanseverelyaffectedthequalityandquantityofsesameeveryyear．Ingeneral，Peoplesolvethisproblembychangingthefarm

8、ingmethodsandsprayingagents，buttheformerdoesnotverygoodwhilethelatterincreasestheinvestmentinallaspectsandisalsoharmtotheenvironmentthatenrichmentofpesticideswilleven