广西地方标准《水牛胚胎冷冻保存技术操作规程》征求意见稿

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1、ICS65.020.30B43DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXX—XXXX水牛胚胎冷冻保存技术操作规程ManipulationproceduresforcryopreservationofembryosinbuffaloXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXX—XXXX目次前言II1　范围12　规范性引用文件13　术语与定义14　试剂、耗材、设备和实验室要求25　冷冻胚胎的选择和标记26　冷冻载体的准备37　胚胎的冷冻38　贮存与运输49　胚胎的解冻4附录A（规范性附录）　试剂

2、、耗材和设备5附录B（规范性附录）　胚胎冷冻和解冻液体7附录C（规范性附录）　胚胎冷冻和解冻记录表88DB45/TXXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区水牛研究所。本标准主要起草人：杨春艳、尚江华、郑海英、梁贤威、鄢胜飞、李孟琪、黄芬香、于农淇。8DB45/TXXXXX—XXXX水牛胚胎冷冻保存技术操作规程1　范围本标准规定了水牛胚胎超低温冷冻技术规程，包括程序化冷冻和玻璃化冷冻技术要求。本规程适用于水牛胚胎超

3、低温冷冻技术推广应用的规范化操作。本规程特指体内胚胎和通过体外受精、单精子胞质内显微受精、体细胞核移植技术生产的胚胎。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB/T25881牛胚胎标准第4部分：牛胚胎发育阶段划分和牛胚胎分级评定3　术语与定义下列术语和定义适用于本标准。3.1　超低温保存cryopreservation经特殊方法处理的胚胎放置在－196℃（液氮）的超低温度中，使其新陈代谢暂时停

4、止，从而将胚胎进行长期保存。3.2　体内胚胎invivoembryos通过激素促进母畜超数排卵，而后采用自然交配或人工授精，从母畜的输卵管或子宫角内回收发育到一定时期的早期胚胎。3.3　水牛胚胎体外生产技术invitroproduction,IVP指模拟水牛体内环境，在体外人工控制条件下，通过采集水牛卵巢上未成熟的卵母细胞经体外成熟培养、精子体外获能、精卵体外受精和受精卵胚胎体外培养等技术生产胚胎。3.4　体外受精invitrofertilization,IVF模拟体内环境使哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。在生物学中，把体外受

5、精胚胎移植到母体后获得的动物称为试管动物(test-tubeanimal)。3.5　8DB45/TXXXXX—XXXX胞浆内单精子注射技术intracytoplasmicsperminjection,ICSI借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精，并在体外发育成胚胎的技术。1.1　体细胞核移植somaticcellnucleartransfer,SCNT将一个动物的体细胞核移入去核的成熟卵母细胞中，产生与供体动物遗传成份基本一致的动物后代技术。2　试剂、耗材、设备和实验室要求2.1　试剂所用试剂、药品以及要求见附录A.1。2.2　耗材所用耗材见附录

6、A.2。2.3　设备所用主要设备见附录A.3。2.4　实验室要求工作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室等组成。其中，缓冲间面积不得小于3平米，要求安置更衣柜和紫外灯，紫外灯强度不得低于1.5W/m3。紫外灯管距地面距离不应超过2.5m，每次照射时间为20～30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级，操作区应达到百级。3　冷冻胚胎的选择和标记3.1　各胚胎发育阶段和质量等级的标记胚胎发育阶段划分和胚胎分级评定应符合GB/T25881规定。但由于水牛胚胎的发育时间相较于牛快，因此所有水牛胚胎发育阶段应提前12h。而且胚胎产品冷冻前后的质量应达到B级（含

7、B级）以上。桑椹胚（ML）、致密桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（BL）、扩张囊胚（EXB）、孵化囊胚(HB)的缩写需统一规范。3.2　不同种类胚胎的标记体内胚胎标记为IVE，体外受精胚标记为IVF，胞质内单精子显微注射胚胎标记为ICSI，体细胞核移植胚胎标记为SCNT。3.3　胚胎标记范本细管上标记的胚胎信息含冷冻时间、胚胎种类、胚胎个数、发育阶段、质量。如2017年7月20日冷冻2枚A级IVF扩张囊胚，其登记的序号为101，则标记为170720IVF2EXBA101。而如果是当天冷冻两枚A级体细胞核移植扩张胚胎，其细胞供体牛的序号为4001，则标

8、记为170720SCNT2EXBA4001。同时做好详尽的胚胎冷冻