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1、b人胰岛素的制备bb一、获得目的基因从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1,细胞总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。2，从总RNA中分离mRNA：取上述提取的总R
2、NA若干，加入BufferOBB，OligotexSuspension，打匀。70℃水浴（裂解RNA的二级结构），20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。（二）mRNA转录合成cDNA第一链cone第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-freewater，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体
3、系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP（加入放射性同位素利于检验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42℃bb放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链。PCR法的操作步骤：预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸²前端引物：²5’-ggttccggatctggttctggttctctggtcccccgcggtagtcaccacc
4、accaccaccaccgttttgtgaaccaacacctgtgcggc-3’²后端引物：²5’-agtgtcgacttagttgcagtagttctccagctggta-3’一、组建重组质粒采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。１.双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。２.重组过程pQE--30用Hin
5、dⅢ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用HindⅢ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为HindⅢ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的HindⅢ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的HindⅢ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。三、构建基因工程菌(一)重组人胰岛素的大肠杆菌
6、工程菌的构建A链和B链同时表达法将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA的转化1,CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：bb取100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体，用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1ml冰冷的75
7、mMCaCl2溶液悬浮菌体，冰浴放置12-24小时，备用。2，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组，DNA连接液，混匀。冰浴放置半小时。在42℃保温2分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1–2分钟。加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增）。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。经典的CaCl2转化方法：a将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。 b弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液
8、10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 c弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 d感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃。e从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 f加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 g42℃水浴中热击90秒或37℃水
