急、慢性缺氧对斑马鱼幼鱼神经系统损伤机制的初步研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文急、慢性缺氧对斑马鱼幼鱼神经系统损伤机制的初步研究Pilotstudyofmechanism0fnerVoussystemdamageofzebrafishlarVaecausedbyacute0rchronichypOxia课题来源：学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院2014赵丹王斌儿科学专业学位硕士珠江医院硕士学位论文舢㈣m删唧洲删哪m婴Y2618559急、慢性缺氧对斑马鱼幼鱼神经系统损伤机制的初步研究硕士研究生：赵丹指导教师：王斌摘要研究背景围

2、产期多种因素可导致胎儿或新生儿不同程度的缺氧性脑损伤，多见于围产期窒息。脑部受到缺氧损伤可能会导致终生的智力障碍和行为能力丧失，如自闭症谱系障碍、脑性瘫痪、抑郁、癫痫和智力缺陷等。缺氧引起的脑损伤机制一直未能充分阐明，且目前尚无有效的药物及治疗方法改善围产期缺氧所致的脑损伤。随着医学的发展，虽然对于新生儿缺氧性脑损伤的研究已有一定的进展，但要达到完全阐明发病机制并最终有效治疗的目的，仍需要长期进行大量的研究工作。深入研究新生儿缺氧缺血性脑损伤发病机制、寻找有效的防治方法是国内外儿科领域的重要课题。大

3、多数疾病的深入研究往往得益于动物疾病模型的有效建立，缺氧性脑损伤也是如此。近年来，新兴的模式生物——斑马鱼迅速成为科研者所青睐的模式生物，其在研究神经系统发育及相关疾病发生发展过程中的作用是其他模式生物难以取代的：与线虫、果蝇等经典模式生物相比，斑马鱼作为一种脊椎动物，在基因组、蛋白质组、胚胎发育以及疾病发病机制等方面均表现出与人类相似性高的特点；与小鼠相比，斑马鱼具有体积小、繁殖能力强、繁殖周期短、生长迅速、体外受精、胚胎透明等优点，因此可在体直观观察各器官系统发育过程，有利于神经系统疾病发病机制

4、的研究及神经营养药物的高通量筛选。利用斑马鱼这一模式生物研究神经系统发育并建立缺氧性脑损伤模型，为今后缺氧性脑损伤发生机制的深入探索、新通路的发现及新药物的高通量筛选提供新摘要的理论依据。研究目的1．模拟缺氧窒息环境，建立斑马鱼幼鱼缺氧性脑损伤模型，为新生儿缺氧性脑损伤提供经济、高效、便捷的实验动物模型；2．比较急、慢性缺氧时斑马鱼幼鱼脑组织氧化应激指标以及HIF．10c、EPO、p53表达的变化，分析斑马鱼幼鱼在急、慢性缺氧环境中脑组织的损伤机制，为迸一步从基因水平探讨斑马鱼幼鱼缺氧性脑损伤发生机

5、制提供新的思路；3．比较缺氧前、后斑马鱼幼鱼脑组织神经系统相关基因nestin、mbp、syn2a的表达差异，初步探讨差异表达的基因在缺氧后自身修复过程中的调控机制，为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗提供新的靶点。研究方法同一批次斑马鱼产下的6dpf幼鱼随机分为正常对照组、慢性缺氧组和急性缺氧组。首先将慢性缺氧组预先放入缺氧装置，再向水中充入高纯氮气进行缺氧，到达实验终止时间点，将所有缺氧后的幼鱼捞出，即慢性缺氧组；当水中溶氧量小于O．5mg／L时，将急性缺氧组放入缺氧装置中，建立斑马鱼幼鱼急性缺氧性脑损

6、伤模型。采用神经行为学观察、HE染色观察脑组织病理变化等方法，对斑马鱼幼鱼缺氧模型进行评价；通过活体成像技术观测各组幼鱼的存活状况、形态、心率(heanrate，HR)和运动能力等指标；HE及甲苯胺蓝神经染色后，观察受损脑组织病理形态的改变；各氧化应激指标检测试剂盒测定各组斑马鱼幼鱼脑组织一氧化氮(NO)浓度、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(sOD)活性等氧化应激指标，探索缺氧对斑马鱼幼鱼脑组织损伤的氧化应激机制；采用吖啶橙染色观察各实验组斑马鱼幼鱼脑部细胞的凋亡情况，用实时荧光定量PCR(q

7、RT-PCR)的方法，对不同缺氧组斑马鱼幼鱼脑组织HIF．10【、EPO、p53基因表达以及缺氧前后nestin、mbp、syn2a基因表达变化进行差异性分析。结果II硕士学位论文1．斑马鱼幼鱼缺氧性脑损伤模型和脑组织损伤评估：斑马鱼幼鱼缺氧后心率较正常组有明显差异(p<0．05)，出现活力下降、游程缩短、静止不动等神经行为改变；正常对照组幼鱼脑组织结构形态无异常改变，缺氧组斑马鱼幼鱼脑组织细胞出现凋亡小体，HE染色可见缺氧组幼鱼脑室萎缩，部分神经元肿胀，细胞收缩变圆，胞浆浓缩等病理变化。2．急性缺

8、氧组和慢性缺氧组缺氧损伤程度对比a)正常对照组、慢性缺氧组、急性缺氧组心率总体均值存在差异(p<0．05)，差异具有统计学意义。急性缺氧组心率较正常对照组偏快，而慢性缺氧组则较正常对照组慢：b)慢性缺氧组与急性缺氧组缺氧后复苏时间存在差异(p<0．05)，急性缺氧组幼鱼缺氧后复苏时间较慢性缺氧组短，差异具有统计学意义。c)缺氧后14天内，正常对照组、慢性缺氧组、急性缺氧组的中位生存时间(天)分别为13．00、1．00、7．00，生存曲线整体Log．Rallk检验分析各