异种活性脱细胞肌腱支架的初步构建

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1、南方医科大学2011级博士学位论文异种活性脱细胞肌腱支架的初步构建Preliminaryconstructionofbioactivedecellularizdtendonxenograft课题来源：自选学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院周沫李宝兴人体解剖与组织胚胎学学术型博士基础医学院2014年3月27日广9小㈣Y261㈣8422异种活性脱细胞肌腱支架的初步构建博士研究生：周沫指导老师：李宝兴摘要第一章牛脱细胞肌腱支架制备目的：采用多次脱细胞循环处理去除牛肌腱腱细胞、利用交联剂交联脱细胞支架增强力学强度、过氧乙酸及冷冻干燥增加空隙率、最后进行灭菌处理制备异种脱

2、细胞肌腱支架，并通过多项检测指标评价制各的脱细胞肌腱支架去除抗原和细胞成分的效果、检测交联程度和力学性能，评价体内外组织相容性，为异种肌腱的应用提供实验依据。方法：取健康成年牛腱，于-80℃深冻保存1个月，室温复融后进行a一半乳糖苷酶消化及脱细胞处理：PBS缓冲液中浸泡数小时，根据实验设计选择添加0【．半乳糖苷酶；胰蛋白酶溶液消化数小时，用含胎牛血清的DMEM培养基终止胰酶消化：于聚乙二醇辛基苯基醚，脱氧胆酸钠混合液中脱细胞，更换脱细胞溶液，重复脱细胞循环数次，PBS反复清洗；EDTA浸泡数小时；DMEM培养基浸泡，PBS反复清洗：利用京尼平交联脱细胞肌腱数小时，PBS反复清洗

3、：DMEM培养基浸泡后置于过氧乙酸一乙醇溶液中，PBS反复清洗；-80。C深冻后冷冻干燥；15kGy^r射线辐照制备脱细胞肌腱支架。取新鲜深冻及不同脱细胞循环处理牛肌腱，HE染色后光学显微镜观察细胞去除情况及肌腱纤维组织形态学特征，荧光显微镜下观察DAPI染色样本DNA和RNA去除情况。取新鲜深冻，脱细胞未经c【．半乳糖苷酶处理(1～7个脱细胞循环)，Ⅱ一半乳糖苷酶处理样本，分别进行抗a一半乳糖基抗原ELISA定量：取一20％保存样本室温消融，分别将组织样本充分剪碎至匀浆。取0【．galELISA试剂盒室温平衡，分别设空白孔(空白摘要对照不加样本及酶标试剂，其余各步操作相同)、

4、标准孔、待测样本孔。在酶标包被板上标准品准确加样50u1，待测样本孑L中先加样本稀释液40斗1，然后再加待测样本10J．tl(终稀释倍数为5)，样本加于酶标板孔底，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；封板膜封板后置37。C温育30min：揭除封板膜，弃液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30rain后弃去，重复5次，拍干：加入酶标试剂，509l／孑L，空白除外；37。C温育30min；洗涤液清洗5次，拍干；加显色剂A，509l／孔，再加显色剂B，50山／孔，震荡混匀，37℃避光显色10min加终止液终止反应，50F1／孔：以空白孔调零，450nm波长测量各孑L吸光度(OD值)。以标准物的

5、浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，根据样本OD值由标准曲线查出相应浓度，乘稀释倍数计算样本实际浓度根据Ⅱ．半乳糖基浓度确定脱细胞循环次数；扫描电子显微镜(SEM)观察新鲜深冻及脱细胞肌腱支架的脱细胞程度及纤维结构。取新鲜深冻，脱细胞处理(1-7个脱细胞循环)样品，以E．Z．N．A．TMTissueDNAKit禾U用NANODROP2000分光光度计检测样本总DNA：称取实验样本，充分研碎后JJHTL缓冲液、OB蛋白酶混匀后温浴过夜；=!jHRNA酶后高速离心，吸取上层悬液与BL缓冲液充分混匀，温育后加无水乙醇，强力震荡充分混匀；取HiBind⑩DNA柱放置于收集管内，将

6、之前所制备样本加入DNA柱内，高速离心后弃液体；将DNA柱放入新的收集管内，HB缓冲液冲洗，高速离一tl,后弃液体及收集管；将DNA柱放入原收集管内，用DNA清洗缓冲液冲洗，高速离一tL,后弃液体保留收集管；将DNA柱放入原收集管内，同上清洗；将DNA柱放入原收集管内，最大速度离心后将DNA柱放入无菌离心管内，添加预热洗脱缓冲液，室温静置数分后高速离心，重复洗脱；提取DNA溶液即用或一80℃保存备用。根据残余DNA量确定脱细胞循环次数。综合组织学观察、扫描电镜观察、a．半乳糖基浓度以及残余DNA量确定脱细胞循环次数。采用茚三酮法利用分光光度计在570nm下测量吸光度，测定京尼平

7、交联度：(1)柠檬酸、NaOH和氯化亚锡混合，加去离子水调至25ml，另将茚三酮加入25ml乙二醇甲醚中，再将上述两液体混合搅拌，制成茚三酮溶液，避光保存。(2)称博士学位论文取样品，加入茚三酮溶液，100℃水浴20min，冷却至室温，加异丙醇溶液，用分光光度计在570nm下测量吸光度。以甘氨酸溶液做标准曲线(n／M，n／4M，n／8M，n／16M，n／32M，)，并通过此标准曲线查找各样本中自由氨基酸的摩尔数。利用异丙醇替换法计算深冻及脱细胞肌腱支架的孔隙率。对新鲜深冻肌腱和脱细胞肌腱支架